L-天冬氨酸α-脫羧酶生產(chǎn)β-丙氨酸的研究.pdf

1、本論文建立了2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相色譜法直接檢測(cè)β-丙氨酸與L-天(門)冬氨酸的新方法。該方法色譜條件為：色譜柱為Zorbax SB C18柱(5μm，4.6*250mm)；流動(dòng)相A為0.02mol/LNaAc-HAc緩沖液，pH6.2，流動(dòng)相B為乙腈，采用線性梯度洗脫：時(shí)間(min)0→20，流動(dòng)相B(體積百分含量，％)5→33；流速為1.0mL/min：柱溫為30℃；檢測(cè)器為紫外可見光檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為360nm，參比波

2、長(zhǎng)為600nm；進(jìn)樣量為20μL。 采用基因工程的手段，用PCR技術(shù)擴(kuò)增了E.coli DH5α中編碼L-天冬氨酸α-脫羧酶的panD基因，將panD基因連接入表達(dá)載體pET28b(+)中形成重組質(zhì)粒pET28b(+)-panD，再轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌E.coliBL21(DE3)，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得了高表達(dá)L-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-panD。對(duì)工程菌和對(duì)照菌株E.col

3、i DH5α、E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)進(jìn)行產(chǎn)酶比較，發(fā)現(xiàn)工程菌的產(chǎn)酶能力有極大提高，經(jīng)0.4mmol/L的IPTG和8g/L乳糖誘導(dǎo)后酶活分別為98.00U和150.91U，摩爾產(chǎn)物得率分別為14.11％和21.73％，而對(duì)照菌株用相同方法檢測(cè)不到β-丙氨酸。 對(duì)工程菌E. coli BL21(DE3)/pET28b(+)-panD的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的發(fā)酵

4、條件為：以1％接種量將種子液接入裝液量為50mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)2h后，添加乳糖至終濃度為10g/L，30℃、150r/min誘導(dǎo)24h。以優(yōu)化后的工藝條件進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，酶活達(dá)到224.96U，比優(yōu)化前提高了448.01％。對(duì)工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-panD的轉(zhuǎn)化工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后工藝條件：底物為0.02mol/L、pH4.49的L-天冬氨酸鈉鹽；轉(zhuǎn)化溫度