谷氨酸脫羧酶基因的克隆與表達.pdf

1、谷氨酸脫羧酶(GAD，EC 4.1.1.15)是催化谷氨酸脫羧形成抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸(GABA)的關鍵限速酶，包括GAD65和GAD67兩種形式同工酶，在醫(yī)學、食品工程等方面都有重要的應用。其中GAD65是胰島素依賴癥糖尿病人(1型糖尿病)血清中自抗體的靶抗原。在1型糖尿病病人的血清中可以檢測出多種針對胰島B細胞的自身抗體，如胰島細胞抗體(ICA)，胰島素抗體(IAA)，GAD抗體(GAAS)，羧肽酶H抗體等，查明自身免疫反應的

2、始動靶抗原對明確發(fā)病機制至關重要，GAD抗體早在1型糖尿病人癥狀出現(xiàn)10年前就出現(xiàn)，對提前診斷極有幫助，因而純化的GAD65蛋白質(zhì)最有潛力成為早期糖尿病診斷的工具，同時，采用純化的GAD65可以預防胰島炎和1型糖尿病的發(fā)病。而GAD67溶于胞漿，是一種胞漿酶，GAD67與輔酶PLP的親和力低，呈高飽和結合；主要以活性的酶型式(holoGAD)存在，在胞漿內(nèi)新陳代謝區(qū)催化谷氨酸生成抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA，醫(yī)學上常利用GAD67的表達來研究

3、治療癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。 由于人源GAD的來源有限，使其作為糖尿病的診斷預測試劑價格相對較高，限制了其在醫(yī)藥方面的應用。本研究利用RT-PCR特異性擴增了人源的GAD65抗原決定簇，得到1.5k的目的片斷，構建重組表達質(zhì)粒pQE30-GAD65,并轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15中進行誘導表達，獲得了以包涵體形式存在的目的片斷以及部分截短的蛋白。包涵體變性復性后與糖尿病人血清反應呈陽性，表明了蛋白表達的初步成功。 另外以活性表達為目的

4、，特異性擴增了GAD67的全序列。利用帶有促溶標簽Trx·Tag，S·Tag的表達載體pET 32a(+)，提高表達產(chǎn)物可溶性；并將構建好的載體轉(zhuǎn)入帶有稀有的密碼子AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA的tRNAs的宿主菌Rosetta中，以確保蛋白表達的順利進行。同時探索了谷氨酸脫羧酶活性的測定，并繪制了標準曲線的Y=0.0213X+0.0319(Y代表A630；X代表GABA的量，ug)，R<'2>=0.993，線形關系良好