植物乳桿菌谷氨酸脫羧酶的異源表達(dá)及條件優(yōu)化.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，作為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)存在。由于其具有提高人體記憶力、調(diào)節(jié)血清血脂、調(diào)節(jié)血壓、降低糖尿病和癌癥風(fēng)險(xiǎn)等作用，廣泛應(yīng)用于功能性食品和保健食品中。但由于GABA天然含量較低，利用谷氨酸脫羧酶(GAD)催化谷氨酸生物合成GABA是目前的研究熱點(diǎn)。本文將實(shí)驗(yàn)室保存的植物乳桿菌GAD基因在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中克隆重組表達(dá)，并對(duì)重組蛋白的表達(dá)和GABA轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了初步優(yōu)化1.

2、以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中植物乳桿菌GAD基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物，克隆得到Lactobacillusplantarum ZJ3443 GAD編碼基因gad。生物信息學(xué)分析表明:該基因全長(zhǎng)為1410bp，GC含量為47.4％，共編碼469個(gè)氨基酸，其氨基酸序列中不含信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。將gad克隆至表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)，轉(zhuǎn)化宿主后得到重組菌Escherichia coli BL21(DE3)(pET-22b/gad)。SDS-PAGE電泳分析表明，經(jīng)

3、IPTG誘導(dǎo)后，GAD在宿主細(xì)胞胞內(nèi)成功表達(dá)為有活性的蛋白，胞內(nèi)酶活為5.5U/mg。進(jìn)一步通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，重組細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化谷氨酸合成γ-氨基丁酸的能力。
　　2.對(duì)重組菌E.coli BL21(DE3)(pET-22b/gad)發(fā)酵表達(dá)GAD的過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。綜合考慮細(xì)胞得率及胞內(nèi)GAD酶活，最優(yōu)發(fā)酵條件為:TB培養(yǎng)基，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.6mM，誘導(dǎo)溫度為30℃，誘導(dǎo)起始菌體濃度OD600為2。在此培養(yǎng)條件下，10m

4、L培養(yǎng)體系所得的細(xì)胞完全催化10mL、0.1M的谷氨酸所需時(shí)間從130 min縮短到80min，單位培養(yǎng)體積中所得細(xì)胞的總催化效率顯著提高。
　　3.通過(guò)破壁、鹽析、Ni2+親和層析純化得到電泳純的重組GAD。酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，重組酶的比酶活為43.12U/mg;最適反應(yīng)溫度為40℃，同時(shí)其熱穩(wěn)定性較差;最適反應(yīng)pH為4.5，在pH3和4下相對(duì)穩(wěn)定;多數(shù)金屬離子對(duì)重組GAD催化活性影響不大，EDTA、Zn2+、SDS對(duì)酶活具有一定

5、的抑制作用，Ca2+對(duì)酶活有一定的激活作用。重組酶谷氨酸合成γ-氨基丁酸的Km為6.55mM，Vamx為2.827mM/min。
　　4.將gad基因克隆至枯草芽孢桿菌質(zhì)粒pMA5，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pMA5/gad，轉(zhuǎn)化Bacillussubtilis WB600，實(shí)現(xiàn)了GAD在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)在LB中添加20g/L甘油和10g/L尿素提高了重組細(xì)胞生物量及胞內(nèi)GAD酶活。對(duì)重組枯草芽孢桿菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化谷氨酸的條件