生物合成γ-氨基丁酸酵母菌谷氨酸脫羧酶基因的克隆及表達.pdf

1、γ-氨基丁酸(γ-Amino Butyric Acid，GABA)是一種天然存在于某些生物體內(nèi)的非蛋白質(zhì)氨基酸。具有降血壓、抗焦慮、治療癲癇病、鎮(zhèn)靜安神、控制哮喘、調(diào)節(jié)激素分泌、促進生殖和活化肝腎等多種生理功能，其制備和應(yīng)用廣受人們的關(guān)注與重視。谷氨酸脫羧酶(Glutamic Acid Decarboxylase，GAD：EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸的α位脫羧反應(yīng)，生成γ-氨基丁酸，是生物催化谷氨酸脫羧生成GABA的限速酶，GA

2、D是調(diào)控GABA產(chǎn)量的關(guān)鍵基因。 本研究以實驗室篩選獲得的1株高產(chǎn)GABA酵母菌菌株為GAD來源，利用PCR擴增技術(shù)克隆得到酵母菌全長GAD，對該基因進行了序列、同源性及功能分析，探索酵母菌GAD與其它微生物GAD的相似性；分別構(gòu)建了酵母菌GAD原核/真核表達載體，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌(Escherichia coli)BL21(DE3)原核表達宿主細(xì)胞和巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115真核表達系統(tǒng)

3、中進行誘導(dǎo)表達。發(fā)酵產(chǎn)物用SDS-PAGE檢測。具體結(jié)果如下： 1.生物合成γ-氨基丁酸酵母菌菌株的篩選 從梨、蘋果、獼猴桃等水果表面不同部位分離得到56株產(chǎn)生γ-氨基丁酸的酵母菌菌株，其中分離篩選到1株相對高產(chǎn)GABA(產(chǎn)量為4.727 g/L)的酵母菌菌株MJ2，經(jīng)初步鑒定該菌株為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。對菌株MJ2的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件用單因素輪換試驗和正交試驗進行整體優(yōu)化。結(jié)

4、果表明菌株MJ2轉(zhuǎn)化富集GABA的適宜條件為：以可溶性淀粉為碳源、牛肉膏為氮源，初始pH5.5、培養(yǎng)溫度31℃、搖床速度180 rpm時，發(fā)酵培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液中GABA的產(chǎn)量最高可達7.539 g/L。 2.酵母GAD克隆及序列分析 以MJ2酵母菌菌株為GAD來源，采用改良的液氮-CTAB法抽提酵母菌基因組DNA，根據(jù)啤酒酵母GAD序列兩端區(qū)域設(shè)計一對特定引物，利用PCR擴增獲一長度為1758 bp的目的片段，并將該

5、基因命名為Scgad。在核苷酸水平上，Scgad全長DNA序列與啤酒酵母(S.cerevisiae)、假絲酵母(Candida glabrata)和乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)GAD的DNA序列相似性分別為98％、69％和67％。由Scgad所推導(dǎo)出的氨基酸序列全長為585個氨基酸(1755 bases，MW=65.897 KDa)。在氨基酸水平上，與啤酒酵母、假絲酵母和乳酸克魯維酵母GAD的氨基酸序列相似

6、性分別為100％、65％和62％。 3.酵母GAD的原核表達 將擴增獲得的Scgad的核苷酸編碼序列插入到原核表達載體pET30a(+)中，構(gòu)建了重組原核表達載體pET30gad，再通過PCR和酶切鑒定確認(rèn)該重組質(zhì)粒已轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)原核表達宿主細(xì)胞BL21(DE3)中，并通過IPTG誘導(dǎo)表達外源重組蛋白。 4.酵母GAD的真核表達 將擴增獲得的Scgad的核苷酸編碼序列插入到畢赤酵母表達載