谷氨酸脫羧酶在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)及固定化酶法生產(chǎn)γ-氨基丁酸.pdf

1、γ-氨基丁酸(GABA)是一種普遍存在于自然界中的非蛋白質(zhì)類的氨基酸，它可由谷氨酸或其鈉鹽經(jīng)谷氨酸脫羧酶(GAD)在一些輔因子的輔助下催化轉(zhuǎn)化而來。GABA具有使血壓降低、治療癲癇類疾病、保肝利腎、預(yù)防哮喘、調(diào)節(jié)激素的分泌水平、鎮(zhèn)靜安神、增強(qiáng)記憶力等重要的生理功能。本論文利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GABA，具有安全系數(shù)高、成本低的特點(diǎn)，首先，以基因工程技術(shù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建能夠高效表達(dá)谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌工程菌。其次，采用固定化技術(shù)，利用固定化的G

2、AD發(fā)酵生產(chǎn)GABA，避免直接用工程菌生產(chǎn)GABA帶來的安全隱患。最后，通過固定化酶的反復(fù)使用有效降低生產(chǎn)成本。
　　本研究首先從Lactobacillus plantarum22144和E.coli AS1.505中分別克隆gad基因，構(gòu)建了重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coliBL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)，兩種工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，都能

3、夠表達(dá)GAD蛋白，其分子量均在53kDa左右，但基因序列差別很大，同源性僅58％，氨基酸序列相似性更低，為45％。通過HPLC比較E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pET-28a-AS1.505-gad)的谷氨酸脫羧酶酶活力，最終選擇酶活力較高的E.coli BL21(DE3)(pET-28a-22144-gad)作為研究對象。
　　利用信號肽分泌表達(dá)、與融合

4、標(biāo)簽融合表達(dá)和與分子伴侶共表達(dá)3種在大腸桿菌中提高外源蛋白可溶性表達(dá)的策略，分別構(gòu)建了E.coliBL21(DE3)(pET-22b-22144-gad);E.coli BL21(DE3)(pET-22b-22144-gad,Δpe1B);E.coli BL21(DE3)(pMAL-c2X-22144-gad);E.coli BL21(DE3)(pMA-c2X-22144-gad(TGA)）;E.coli BL21(DE3)(pET-2

5、8a-SUMO-22144-gad)和E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL· ES，pET-28a-22144-gad)共6株重組大腸桿菌。通過比較重組蛋白的可溶性表達(dá)量及酶活力高低，發(fā)現(xiàn)E.coliBL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES，pET-28a-22144-gad)可以提高GAD的可溶性表達(dá)，且酶活力最高，在酶活測定條件下對MSG的轉(zhuǎn)化率可達(dá)95％以上，確定利用其表達(dá)外源蛋

6、白GAD。
　　為提高E.coli BL21(DE3)(pACYCDuet-1-GroEL·ES，pET-28a-22144-gad)對GAD的可溶性表達(dá)，及提高細(xì)胞破碎率，減少細(xì)胞破碎對酶活性的損害，對誘導(dǎo)溫度、IPTG添加量等誘導(dǎo)表達(dá)條件和破碎緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化，最后獲得的誘導(dǎo)及破碎條件為:IPTG添加量為0.1 mM，誘導(dǎo)溫度25℃，140 rpm誘導(dǎo)表達(dá)10h后，每5OD600離心后的菌體加0.5 mL TGE緩沖液進(jìn)行超聲

7、破碎。對超聲破碎處理得到的GAD粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，其酶的最適催化pH=4.6，最適催化溫度為37℃，酶活力可達(dá)1.86 U/mL。
　　分別用陰離子交換樹脂、陽離子交換樹脂、環(huán)氧基樹脂和氨基化樹脂對酶進(jìn)行固定化，結(jié)果表明氨基化樹脂LX-1000EA在pH4.6的緩沖液中對酶固定化效果最好，可以達(dá)到約50％的酶回收率。通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)對酶固定條件進(jìn)行優(yōu)化，得出用氨基化樹脂LX-1000EA固定

8、谷氨酸脫羧酶的最佳條件為:固定化時(shí)間7.5 h、固定化溫度42℃、載體g∶酶U=1∶7.5，酶活力可達(dá)4.22±0.1 U/g。固定化酶IGAD的酶學(xué)性質(zhì)為:最適催化pH=4.8，比游離酶(pH=4.6)偏高;在pH=3-5的偏酸性條件下，酶的穩(wěn)定性較強(qiáng);IGAD的最適催化溫度與游離酶相似，為37℃，該條件下酶活力約4.4 U/g;酶的熱穩(wěn)定性較好，在45℃保存8h仍保留80％的酶活，但溫度越高酶活喪失越嚴(yán)重。所以IGAD應(yīng)在偏酸性低溫