鳥氨酸脫羧酶(ODC)抑制劑的作用機(jī)制探究.pdf

1、目的：鳥氨酸脫羧酶(Ornithine Decarboxylase，ODC)是細(xì)胞內(nèi)多胺合成的限速酶，對控制細(xì)胞內(nèi)多胺含量具有重要作用，由此成為當(dāng)前抗腫瘤藥物設(shè)計(jì)新的分子靶點(diǎn)。ODC在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平的改變，會(huì)影響多種生長因子功能，刺激致癌基因的表達(dá)，并且會(huì)影響多胺水平，因此細(xì)胞內(nèi)ODC的表達(dá)在轉(zhuǎn)錄、翻譯和譯后各階段均受到嚴(yán)格調(diào)控。二氟甲基鳥氨酸（DFMO）是ODC不可逆抑制劑，其分子結(jié)構(gòu)與鳥氨酸類似，能夠競爭性地與該酶的活性中心結(jié)合而

2、抑制ODC的活性，使多胺的合成減少。在II期臨床試驗(yàn)中，DFMO由于使用劑量高并且毒副作用大而限制了它在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。因此,篩選更高效且毒副作用小的新型ODC抑制劑有重要的臨床意義。在前期的實(shí)驗(yàn)中，綜合應(yīng)用計(jì)算機(jī)模擬高通量篩選和分子、細(xì)胞水平上的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，獲得了一系列可以和ODC結(jié)合，并且明顯抑制其活性的小分子，現(xiàn)階段我們對小分子抑制ODC酶活的機(jī)制進(jìn)行探索。
　　方法：(1)在NCBI基因庫中尋找熒光蛋白YPET、熒光蛋白

3、CyPET、鼠源鳥氨酸脫羧酶ODC及其抗酶（AZ）序列，并將所得質(zhì)粒的基因測序后與之進(jìn)行序列比對。(2)利用所得原核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）并表達(dá)目的蛋白，并利用親和層析，分子篩等獲得較高純度的目的蛋白。(3)建立以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)為基礎(chǔ)AZ和ODC的反應(yīng)體系。(4)使用FRET體系檢測小分子對AZ和ODC單體與二聚體之間親和反應(yīng)的影響。
　　結(jié)果：(1)成功表達(dá)帶有熒光標(biāo)記蛋白CyPET-mAz和YPE

4、T-mODC。(2)以FRET為基礎(chǔ)，建立CyPET-mAz和YPET-mODC的反應(yīng)體系。(3)使用前期檢測對ODC活性有明顯影響的小分子，使用建立的FRET檢測體系檢測出四種小分子對ODC和AZ的親和反應(yīng)有影響。(4)發(fā)現(xiàn)低濃度的D4, D6, D24和D81號小分子可以抑制ODC和AZ的親和反應(yīng)，并且對藥物有濃度依賴性。
　　結(jié)論：通過計(jì)算機(jī)模擬、高通量篩選和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并篩選出一系列能有效抑制 ODC活性的小分子化合