腫瘤抑素基因表達(dá)與腎癌關(guān)系以及鳥氨酸脫羧酶基因表達(dá)對腫瘤抑素表達(dá)調(diào)控作用的研究.pdf

1、第一部分人腫瘤抑素原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)、純化及其多克隆抗體的制備
　　 [目的]
　　 構(gòu)建人腫瘤抑素基因原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá)后純化獲得重組人腫瘤抑素融合蛋白,制備鼠抗人腫瘤抑素抗體,為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.RT-PCR擴(kuò)增腫瘤抑素的編碼序列,TA克隆后NcoⅠ、XhoⅠ雙酶切回收目的片段,插入到原核表達(dá)載體pTriEx-4中,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pTriEx-tumstatin

2、。
　　 2.將pTriEx-tumstatin表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coli JM109,IPTG誘導(dǎo)腫瘤抑素融合蛋白表達(dá),SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)產(chǎn)物。
　　 3.根據(jù)親和層析原理,采用Ni SepharoseTM6 Fast Flow純化出重組人腫瘤抑素蛋白,透析復(fù)性,PEG8000濃縮,SDS-PAGE及western blot鑒定純化產(chǎn)物。
　　 4.純化的腫瘤抑素融合蛋白與免疫佐劑混合,作為免疫

3、原,免疫小鼠,取血清制備鼠抗人腫瘤抑素多抗；ELISA及western blot測定抗血清的效價(jià)及特異性。
　　 [結(jié)果]
　　 1.RT-PCR擴(kuò)增出腫瘤抑素編碼序列。
　　 2.重組表達(dá)質(zhì)粒pTriEx-tumstatin構(gòu)建成功,酶切鑒定及DNA序列分析證明該質(zhì)粒含有腫瘤抑素全部編碼序列,開放閱讀框架正確。
　　 3.pTriEx-tumstatin轉(zhuǎn)化入JM109誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化、復(fù)性、濃

4、縮,SDS-PAGE及western blot鑒定,分子量約為30kD,與預(yù)期結(jié)果相符。
　　 4.制備出鼠抗人腫瘤抑素多克隆抗體,并測定了其效價(jià)及特異性。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了含有人腫瘤抑素基因編碼序列的原核表達(dá)載體pTriEx-tumstatin,并在E.coli JM109中高效表達(dá),經(jīng)Ni SepharoseTM6 Fast Flow純化得到腫瘤抑素融合蛋白；以其為免疫原制備鼠抗人腫瘤抑素多抗

5、,為后續(xù)的研究工作奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分腫瘤抑素基因表達(dá)與腎癌關(guān)系的研究
　　 [目的]
　　 檢測腫瘤抑素在腎癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)水平；構(gòu)建人腫瘤抑素基因真核表達(dá)載體,觀察其對血管內(nèi)皮細(xì)胞及腎癌細(xì)胞增殖的作用。
　　 [方法]
　　 1.半定量RT-PCR和western blot分別檢測腎癌標(biāo)本中腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.半定量RT-PCR和western b

6、lot檢測腎癌細(xì)胞和正常腎細(xì)胞中腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)差異。
　　 3.構(gòu)建含腫瘤抑素基因的真核表達(dá)質(zhì)粒,酶切鑒定并測序分析。
　　 4.以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)重組質(zhì)粒pcDNA-tumstatin轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304和人腎癌細(xì)胞ACHN,RT-PCR及western blot鑒定其在這兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　 5.用CCK-8細(xì)胞活性檢測法檢測pcDNA-tumst

7、atin轉(zhuǎn)染后對ECV304和ACHN細(xì)胞增殖的影響。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)檢測pcDNA-tumstatin轉(zhuǎn)染ECV304細(xì)胞后對細(xì)胞周期分布的影響,western blot檢測腫瘤抑素基因表達(dá)對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白cyclin D1表達(dá)的影響。
　　 [結(jié)果]
　　 1.腎組織標(biāo)本中腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)豐度以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,結(jié)果顯示:腎癌組織中腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯低于正常腎組織中的表達(dá)量

8、。
　　 2.RT-PCR和western blot結(jié)果顯示:腎癌細(xì)胞ACHN中腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯低于胚腎HEK293細(xì)胞中的表達(dá)量。
　　 3.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定,pcDNA-tumstatin中腫瘤抑素基因片段大小符合；DNA測序顯示序列及插入方向正確。
　　 4.RT-PCR及western blot結(jié)果顯示pcDNA-tumstatin能夠在血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304和腎癌細(xì)胞ACHN中

9、表達(dá)。
　　 5.pcDNA-tumstatin轉(zhuǎn)染后可明顯抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304的增殖,而對腎癌細(xì)胞ACHN的增殖無影響。
　　 6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示pcDNA-tumstatin轉(zhuǎn)染的ECV304細(xì)胞周期阻滯在G1期；western blot結(jié)果顯示腫瘤抑素基因表達(dá)抑制G1期主要的細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)。
　　 [結(jié)論]
　　 腎癌組織和細(xì)胞中腫瘤抑素mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào),表明

10、腫瘤抑素的表達(dá)變化可能與腎癌的進(jìn)展有關(guān)。初步證實(shí)腫瘤抑素可作為腎癌治療的治療劑,并通過基因治療手段來持續(xù)給藥。
　　 第三部分鳥氨酸脫羧酶基因表達(dá)對腫瘤抑素表達(dá)調(diào)控作用的研究
　　 [目的]
　　 構(gòu)建鳥氨酸脫羧酶過表達(dá)載體pcDNA-ODC；建立ODC過表達(dá)的HEK293細(xì)胞株;研究ODC基因表達(dá)對腫瘤抑素表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 [方法]
　　 1.半定量RT-PCR檢測腎癌組織中ODC和腫瘤抑

11、素的表達(dá)情況。
　　 2.半定量RT-PCR和western blot檢測癌細(xì)胞中ODC和腫瘤抑素的表達(dá)情況。
　　 3.構(gòu)建含ODC基因的過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ODC,酶切鑒定并測序分析。
　　 4.重新轉(zhuǎn)化與ODC基因翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的ODC反義真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-ODCr,酶切鑒定并測序分析。
　　 5.以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)pcDNA3.1質(zhì)粒和pcDNA-ODC重

12、組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293,利用G418進(jìn)行篩選,3-4周后,挑取單克隆、消化接種后繼續(xù)培養(yǎng)建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,并以western blot鑒定。
　　 6.實(shí)驗(yàn)分為5組,分別為:PBS組、pcDNA3.1空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)組、pcDNA-ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)組、pcDNA-ODC與pcDNA-ODCr共轉(zhuǎn)染組和腐胺處理組。分別提取各組HEK293細(xì)胞總蛋白,western blot檢測ODC和腫瘤抑素蛋白的表達(dá)情況。
　　 7.分

13、別提取上述五組細(xì)胞總RNA,半定量RT-PCR檢測ODC和腫瘤抑素mRNA的表達(dá)情況。
　　 8.構(gòu)建腫瘤抑素啟動子的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,利用脂質(zhì)體將pGL-tumstatin2.2kb質(zhì)粒與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染上述五組細(xì)胞,熒光素酶報(bào)告基因分析檢測啟動子活性。
　　 9.獲取上述五組細(xì)胞的條件培養(yǎng)基,作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304,CCK-8檢測其對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　 [結(jié)果]
　　

14、 1.半定量RT-PCR結(jié)果顯示:38例腎癌標(biāo)本中,有32例ODC mRNA是過表達(dá)的；在這32例ODC過表達(dá)的標(biāo)本中有24例腫瘤抑素mRNA的表達(dá)量低于正常組織中的表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析ODC過表達(dá)與腫瘤抑素表達(dá)下調(diào)有關(guān)。
　　 2.半定量RT-PCR和western blot結(jié)果顯示:腎癌細(xì)胞ACHN、肺癌細(xì)胞A549中ODC mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯高于相應(yīng)的正常細(xì)胞(人胚腎細(xì)胞HEK293和人胚肺細(xì)胞HELF),而腫瘤抑

15、素mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯低于相應(yīng)的正常細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者存在相關(guān)性。
　　 3.經(jīng)限制性內(nèi)切酶和DNA測序鑒定,pcDNA-ODC質(zhì)粒中,ODC基因片段大小符合,插入方向和序列正確。
　　 4.經(jīng)酶切鑒定和測序分析,所轉(zhuǎn)化的pcDNA-ODCr質(zhì)粒,目的片段基因序列及插入方向正確,說明所轉(zhuǎn)化的pcDNA-ODCr質(zhì)粒是攜帶與ODC翻譯起始位點(diǎn)互補(bǔ)的基因序列的ODC反義真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　 5.RT-PCR和

16、western blot結(jié)果顯示:篩選到的含pcDNA-ODC質(zhì)粒的細(xì)胞能夠高水平表達(dá)ODC。
　　 6.RT-PCR和western blot結(jié)果顯示:相對于空白對照組和空載體組,pcDNA-ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)組中ODC mRNA和蛋白的表達(dá)量明顯升高,在轉(zhuǎn)染pcDNA-ODCr的pcDNA-ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組中ODC mRNA和蛋白的表達(dá)量接近空白對照組,腐胺處理組中ODC表達(dá)無明顯變化；而腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)量在pcDNA-

17、ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)組和腐胺處理組中明顯下降,轉(zhuǎn)染pcDNA-ODCr的pcDNA-ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組中腫瘤抑素mRNA和蛋白的表達(dá)量恢復(fù)至正常水平。RT-PCR結(jié)果顯示:各處理組中血管內(nèi)皮生長因子VEGF mRNA的表達(dá)量保持不變。
　　 7.構(gòu)建了腫瘤抑素基本啟動子和已報(bào)道的共用啟動子的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,熒光素酶報(bào)告基因分析結(jié)果顯示兩者都具有啟動子活性,其中pGL-tumstatin2.2kb活性明顯,故選擇該報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。<

18、br>　　 8.培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV304中加入從各處理組獲得的條件培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18h后用CCK-8檢測,結(jié)果顯示:與PBS處理組相比,來自pcDNA-ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)組和腐胺處理組的條件培養(yǎng)基能夠誘導(dǎo)1.41±0.07、146±0.07倍的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖；而來自空載體穩(wěn)轉(zhuǎn)組和pcDNA-ODCr轉(zhuǎn)染的pcDNA-ODC穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞組的條件培養(yǎng)基對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖無明顯影響。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了ODC過表達(dá)