靈芝甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因的克隆及表達特性研究.pdf

1、靈芝（Ganoderma lucidum）是我國傳統(tǒng)的藥用真菌，俗稱“靈芝仙草”。傳統(tǒng)中醫(yī)觀點認(rèn)為靈芝具有益氣、補中、增智及延年益壽等功效；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明靈芝中含有多種生物活性成分，包括三萜類、多糖類、核苷類、呋喃類衍生物、甾醇類、生物堿等，其中三萜類是其主要的活性成分之一，具有抗腫瘤、抑制組織胺釋放、抗HIV及抑制膽固醇的生物合成及吸收等作用。
　　 靈芝三萜類物質(zhì)是靈芝的次級代謝產(chǎn)物，其合成是通過甲羥戊酸途徑進行的。甲羥戊

2、酸途徑是真核細胞中合成甾醇和類異戊二烯的途徑。甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（Mevalonate pyrophosphate decarboxylase，MVD）是甾醇和類異戊二烯合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化類異戊二烯生物合成的第一步反應(yīng)（甲羥戊酸焦磷酸脫羧形成異戊烯焦磷酸）。因此，MVD表達量的高低可能會直接或間接的影響靈芝中三萜類物質(zhì)的含量。由于三萜類物質(zhì)是靈芝的主要生物活性成分，因此研究MVD基因的表達特性對提升靈芝的藥用價值具有重要的意義。

3、
　　 本文首先通過比對已報道的其他物種的MVD的氨基酸序列，根據(jù)保守區(qū)段設(shè)計簡并引物，得到353 bp的靈芝MVD基因特異片段；根據(jù)得到的特異片段分別設(shè)計5′-SEFA和3′-RACE特異引物，通過PCR擴增分別得到該基因的5′末端基因組序列、啟動子序列和3′末端cDNA序列；對得到的片段進行拼接、排除可能的內(nèi)含子后設(shè)計引物，分別以靈芝基因組DNA和cDNA為模板擴增得到靈芝MVD基因的基因組DNA及cDNA全長。其中基因組D

4、NA全長為1312 bp，cDNA全長為1203 bp，編碼一個由400個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。對靈芝甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因的基因組DNA序列和cDNA序列的對比分析表明，該基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子構(gòu)成，它們的長度分別為55 bp（exon1）、52 bp（intron1）、242 bp（exon2）、57 bp（intron2）和906 bp（exon3）。應(yīng)用MEGA4.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明靈芝MVD與新型隱球菌MVD的親

5、緣關(guān)系最為接近，顯示MVD的進化與物種的進化關(guān)系是比較一致的。結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示MVD含有典型的GHMP激酶結(jié)構(gòu)域。在功能驗證方面，通過把MVD基因克隆到酵母表達載體pYES2中，在功能缺陷型酵母中驗證了該基因的功能。
　　 應(yīng)用Western Blot方法從蛋白水平檢測MVD的表達情況，首先把MVD基因的開放閱讀框克隆到pET-24b原核表達載體中，陽性重組子轉(zhuǎn)化至表達菌Rosetta（DE3）中進行IPTG誘導(dǎo)表達，通過鎳柱對得

6、到的包涵體蛋白進行純化；將得到的純蛋白免疫新西蘭大白兔制備MVD的多克隆抗體，對靈芝的不同發(fā)育階段及茉莉酸甲酯誘導(dǎo)條件下的MVD表達差異進行檢測。另外，我們還通過real-time RT-PCR方法從mRNA水平對其轉(zhuǎn)錄情況進行了檢測。結(jié)果顯示在mRNA水平和蛋白水平，靈芝原基時期的MVD水平都要顯著高于菌絲體時期。mRNA水平檢測顯示茉莉酸甲酯對MVD基因轉(zhuǎn)錄的最佳誘導(dǎo)濃度為100μM；蛋白水平檢測顯示最佳誘導(dǎo)濃度為200μM，但誘導(dǎo)

7、效果并不明顯。另外，我們還構(gòu)建了該基因的超量表達載體，并對靈芝的轉(zhuǎn)化體系進行探索，試圖通過在靈芝中超量表達該基因，進而更進一步的明確該基因的功能。
　　 為了更全面的了解該基因的表達特性，我們還對得到的1193 bp的啟動子區(qū)進行分析，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域除含有7個CAAT box、3個GC box及1個TATA box等典型的真核生物啟動子元件外，還含有兩個真菌激發(fā)子響應(yīng)元件、一個MYBHv1結(jié)合位點、兩個MeJA響應(yīng)元件以及一些光響應(yīng)