腺病毒介導的鳥氨酸脫羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶雙義RNA抑制肺癌A-549細胞的實驗研究.pdf

1、[研究目的] 多胺包括精胺、精瞇和腐胺，是調節(jié)細胞生長的重要物質，它可以通過改變DNA結構和調節(jié)信號傳導途徑等方式調節(jié)基因的表達，從而在細胞生長和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。在多胺的生物合成過程中有兩個限速酶：鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的第一個限速酶，可催化L-鳥氨酸脫羧生成腐胺；S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase，S

2、AMDC)是多胺合成的第二個限速酶，催化S-腺苷蛋氨酸成S-腺苷甲硫基丙胺。國外及國內研究證明在肺腫瘤細胞中多胺的含量明顯增高，鳥氨酸脫羧酶及S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶的含量也明顯增高，并與肺腫瘤的復發(fā)有一定的關系。多數(shù)學者認為多胺的過度生成與腫瘤的發(fā)生有關。如果能有效減弱多胺在腫瘤細胞中的過度表達，則可抑制腫瘤細胞的生長。因而研究抑制多胺合成的關鍵酶的方法就成了進來肺癌治療的熱點。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylas

3、e，ODC)是多胺合成的第一個限速酶，已有研究表明，無論是以ODC競爭性抑制劑二氟甲基鳥氨酸(DFMO)抑制ODC活性還是以ODC為靶標采用反義核酸技術來抑制ODC在肺癌細胞中的表達，都可減少多胺在細胞的含量，從而達到抑制肺癌細胞生長的目的。但鳥氨酸脫酶(ODC)并非多胺合成中的唯一限速酶。S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(s-adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC)是多胺合成的關鍵酶。在腫瘤細胞中S-腺苷甲

4、硫氨酸脫羧酶基因表達含量亦明顯增高。有研究顯示單純抑制ODC的表達只能有效的腐胺水平，SAMDC的活性卻呈反饋性升高，精胺的濃度也相應升高，因而不能很好的抑制多胺的生成。因此認為，如果同時抑制ODC和SAMDC在腫瘤細胞中的表達才能有效降低腫瘤細胞中多胺含量，從而對抑制腫瘤細胞的生長起到關鍵作用。另一方面，雖然利用ODC的抑制物二氟甲基鳥氨酸(DFMO)還是SAMDC的抑制物MGBC和SAM486A等，均能競爭性抑制ODC與SAMDC的

5、生物活性，但其化學性質不穩(wěn)定，非特異性的毒副作用大，不適合臨床應用治療。因此，研究利用基因技術來抑制肺癌細胞中ODC與SAMDC的表達生成及活性迫在眉睫。我們選擇肺癌為目標，利用腺病毒同時轉導ODC基因與AdoMetDC基因的雙反義RNA對肺癌細胞的抑制作用，為進一步研究肺癌基因治療的方法提供理論依據和技術對策。 【研究方法】 ①構建鳥氨酸脫羧酶(ODC)和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(AdoMetDC)雙反義RNA腺病毒載體

6、。 ②體外基因轉染效率的檢測。采用FACS檢測Ad-GFP感染細胞中GFP表達，以測定不同感染復數(shù)(MOI)的腺病毒對肺癌A-549細胞的基因轉染效率。將肺癌.A-549細胞，按3×105個細胞/孔鋪于六孔板中。吸出細胞培養(yǎng)液加入500μlAd-GFP病毒孵育液，感染復數(shù)分別100、50、20、10、5和0。吸出病毒孵育液，加入完全培養(yǎng)基2ml，放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48h。用流式細胞儀計數(shù)GFP陽性細胞及細胞總數(shù)。 ③

7、應用MTF法實驗觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對肺癌A-549細胞生長增殖的影響。測定被不同感染復數(shù)重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染細胞的增殖程度，并繪制不同感染細胞的生長曲線。 ④采用Western印跡檢測肺癌A-549細胞轉染腺病毒(Ad-ODC-AdoMetDCas)后，其ODC和AdoMetDC蛋白表達的量。將肺癌A-549細胞分別感染50 MOI的Ad.GFP,Ad.ODCas租Ad-0DC-A

8、doMetDCas 72 h后收集細胞。用裂解液抽提細胞總蛋白。蛋白樣品濃度采用BCA法測定。 ⑤采用HPLC法檢測肺癌A-549細胞轉染腺病毒(Ad-ODC-AdoMetDCas)后，其多胺的含量。收集107個細胞，用PBS沖洗兩遍后離心。將高氯酸加入到細胞沉淀中離心，取上清液。用HPIC系統(tǒng)測定多胺的含量。 ⑥應用TUNEL標記檢測法觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對肺癌細胞凋亡的影響。腺病毒Ad-ODC-Ad

9、oMetDCas，Ad-ODCas和Ad-GFP分別以50MOI感染A-549細胞后，用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。 【研究結果】 ①基因轉染效率實驗結果顯示，以50MOI的Ad-GFP感染肺癌細胞48h后，大約有75％肺癌A-549細胞GFP表達陽性，但不會引起細胞毒性(圖1)。 ②重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas對肺癌細胞A-549有劑量依賴性的抑制作用(圖2)，根據實驗結果挑選A-549細

10、胞的感染滴度為50MOI。正常情況下A-549細胞生長迅速，而感染Ad-ODC-AdoMetDCas后細胞生長明顯減慢，細胞生長曲線更趨低平(圖3)，最大生長抑制率可達70％，而無明顯細胞毒性。 ③采用Western印跡法顯示以Ad-ODC-AdoMetDCas感染肺癌A-549細胞，可明顯抑制肺癌細胞中ODC和AdoMetDC基因表達，基因抑制率大于60％(p<0.05)，ODC和AdoMetDC含量明顯減少。 ④HP

11、LC結果顯示，肺癌Ad-549細胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后，細胞內三種多胺含量都明顯降低(p<0.05)。 ⑤TUNEL標記檢測結果證實，Ad-ODC-Ad0MetDCas可引起肺癌A-549細胞明顯凋亡。 【研究結論】 本研究結果表明以ODC和AdoMctDC為靶標的反義腺病毒載體可以降低肺癌細胞內多胺含量，能減少ODC和AdoMetDC基因的表達，減少肺癌細胞中的多胺的含量從而了抑制肺癌細胞的