甲基轉(zhuǎn)移酶、精氨酸脫氨酶及乙酰乳酸脫羧酶的催化機理研究.pdf

1、酶是具有生物催化功能的高分子物質(zhì)，與傳統(tǒng)的催化劑相比，酶的催化效率更高、反應(yīng)條件更加溫和并且環(huán)保、無公害，在生物體的生命活動中起到了不可替代的作用。研究酶的催化機理不僅有助于理解酶的生物學(xué)功能，還將為酶的實際應(yīng)用奠定必要的理論基礎(chǔ)。但酶催化的反應(yīng)通常速度很快，僅通過實驗方法很難獲得酶催化反應(yīng)的詳細(xì)信息。近年來量子化學(xué)與計算機技術(shù)的發(fā)展為研究生物大分子體系奠定了基礎(chǔ)。
　　本論文主要采用量子力學(xué)與分子力學(xué)相結(jié)合(QM/MM)的方法對

2、三種酶的催化反應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)的理論研究，在晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上構(gòu)建了合理的計算模型，確定了反應(yīng)的最佳路徑，分析了反應(yīng)中間體、過渡態(tài)的結(jié)構(gòu)特點，給出了反應(yīng)的能量學(xué)信息，在原子水平上詳細(xì)地闡明了酶催化反應(yīng)的機理。理論計算結(jié)果不僅有助于深入理解這些酶的催化反應(yīng)機理，還可為工業(yè)應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。本論文的主要工作如下:
　　(1)大腸桿菌中SAM甲基轉(zhuǎn)移酶催化機理的理論研究
　　甲基轉(zhuǎn)移酶(RlmN)屬于自由基SAM酶，它是一個雙重特

3、異性的酶，既可以催化23S rRNA上2503號腺苷的甲基化又可催化大腸桿菌中轉(zhuǎn)運RNAs(tRNA)上37號腺苷C2的甲基化。本文以RlmN與大腸桿菌tRNA的復(fù)合物（PDB編碼:5HR6）的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)構(gòu)建了計算模型，并應(yīng)用QM/MM研究的甲基化反應(yīng)機理。計算結(jié)果表明RlmN催化腺苷C2原子的甲基化過程遵循自由基反應(yīng)機理，反應(yīng)總共包含四步基元反應(yīng)，5'-dA自由基首先奪取甲基化的半胱氨酸C355上的質(zhì)子，生成C'自由基，然后C'自

4、由基進(jìn)攻A37上的C2原子，生成蛋白質(zhì)-核苷酸交聯(lián)的中間體(IM2);在中間體IM2的分解過程中，C118殘基的奪質(zhì)子過程與C355殘基的C'-S'鍵斷裂是協(xié)同進(jìn)行的，C118殘基將氫原子轉(zhuǎn)移至C'生成最終的產(chǎn)物，其中C'-S'鍵的斷裂過程為催化反應(yīng)的決速步驟，對應(yīng)的能壘為17.4 kcal/mol。這些研究結(jié)果為進(jìn)一步理解RlmN及其同源酶Cfr的催化反應(yīng)提供了理論依據(jù)。
　　(2)牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶催化機理的理論研

5、究
　　牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶催化多肽C-末端精氨酸的胍基化。精氨酸的胍基化反應(yīng)在生理活動和病理過程中廣泛存在。研究牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶的胍基化機理將為該酶在臨床上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。在研究酶的催化機理前，首先確定了活性中心兩個關(guān)鍵殘基C351和H236的質(zhì)子化狀態(tài)，然后對酶催化的胍基化反應(yīng)進(jìn)行了理論計算。結(jié)果表明，反應(yīng)經(jīng)過脫氨和水解兩個連續(xù)的過程，脫氨過程總能壘為20.17 kcal/mol;水解過程中，D23

6、8或H236殘基皆可作為堿活化水分子，并且對應(yīng)相似的能壘(～17 kcal/mol)。
　　(3)短芽胞桿菌中乙酰乳酸脫羧酶催化機理的理論研究
　　乙酰乳酸脫羧酶催化α-乙酰乳酸的對映異構(gòu)體生成單一的產(chǎn)物(R)-乙偶姻。其中(S)-α-乙酰乳酸為自然底物，催化反應(yīng)速度較快，(R)-α-乙酰乳酸為非自然底物反應(yīng)速度較慢。本論文應(yīng)用QM/MM方法研究了乙酰乳酸脫羧酶的催化機理。計算結(jié)果表明，乙酸乳酸脫羧酶對(S)-α-乙酰乳酸的

7、催化反應(yīng)包含兩步基元反應(yīng)，包括底物直接脫羧生成烯醇化物中間體以及烯醇中間體奪取E253殘基上的質(zhì)子生成最終的產(chǎn)物。研究結(jié)果還表明，非自然底物(R)-α-乙酰乳酸活性位點不能直接進(jìn)行脫羧反應(yīng)，需要先經(jīng)過羧基遷移重排為自然的底物(S)-α-乙酰乳酸，然后再按照(S)-α-乙酰乳酸的反應(yīng)機理完成催化反應(yīng)。
　　本論文的特色和創(chuàng)新之處:
　　(1)研究了SAM甲基轉(zhuǎn)移酶(RlmN)的催化反應(yīng)機理，確定了RlmN-tRNA復(fù)合體的分解

8、機制，給出了甲基化過程的決速步驟，在原子水平上總結(jié)了RNA甲基化過程中的自由基傳遞規(guī)律，為深入理解RlmN及其同源酶的催化過程提供了理論依據(jù)。
　　(2)研究了牙齦卟啉單胞菌酞酰精氨酸脫氨酶(PPAD)的胍基化反應(yīng)機理，確定了PPAD酶活性中心半胱氨酸和組氨酸的質(zhì)子化狀態(tài)以及PPAD酶催化反應(yīng)的脫氨和水解過程，解釋了C351-D238-H236催化三聯(lián)體在酶的催化過程中所起的重要作用。
　　(3)研究了短芽胞桿菌中乙酰乳酸脫