蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)在RD細(xì)胞誘導(dǎo)分化中作用機(jī)制的研究.pdf

1、核小體核心組蛋白的尾部有多種共價(jià)修飾，包括乙?；姿峄谆头核鼗?。這些組蛋白的翻譯后修飾可以改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響非組蛋白轉(zhuǎn)錄因子與染色質(zhì)的結(jié)合，在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。與乙酰化不同，對(duì)組蛋白甲基化的作用知之甚少，盡管這種修飾已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)了近40年。當(dāng)初由于不清楚具體發(fā)揮甲基化作用的酶類，很難探討組蛋白甲基化與基因活化之間的直接聯(lián)系。近些年一些具有精氨酸或賴氨酸甲基化作用的酶類陸續(xù)被鑒定出來(lái)。其中蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移

2、酶家族（proteinargininemethyltransferases，PRMTs）就是一類含有高度保守結(jié)構(gòu)域的具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性的酶類。其作用底物非常廣泛，涉及真核細(xì)胞DNA和RNA介導(dǎo)的許多過(guò)程。其修飾組蛋白，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)整mRNA的穩(wěn)定性，參與DNA損傷修復(fù)及裝配剪接復(fù)合體的功能是幾乎所有真核細(xì)胞功能所必需的。
　　 橫紋肌肉瘤（Rhabdomyosarcoma，RMS）起源于肌肉前體細(xì)胞，是一種兒童時(shí)期的軟組織肉

3、瘤，其惡性程度很高且較常見(jiàn)。人類胚胎型橫紋肌肉瘤衍生的RD細(xì)胞，盡管表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子MyoD和生肌蛋白（Myogenin），但未能完成分化。為了深入了解該腫瘤的發(fā)病機(jī)理，探索可能用于體內(nèi)的治療靶點(diǎn)，本文以RD細(xì)胞為模型，從該腫瘤終末分化阻滯機(jī)理出發(fā)，主要研究對(duì)基因轉(zhuǎn)錄具有重要調(diào)控作用的組蛋白修飾酶--蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTs）在TPA（12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）誘導(dǎo)RD細(xì)胞分化

4、過(guò)程中的作用及其機(jī)制，并對(duì)RD細(xì)胞分化過(guò)程中早期分化標(biāo)志--生肌蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的重塑以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的結(jié)合進(jìn)行研究，為橫紋肌肉瘤的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。
　　 一、TPA誘導(dǎo)RD細(xì)胞分化過(guò)程中PRMT家族成員的表達(dá)情況TPA處理RD細(xì)胞過(guò)程中，流式細(xì)胞術(shù)顯示，G2/M期數(shù)值增加，細(xì)胞周期明顯阻滯；RT-PCR、WesternBlot方法檢測(cè)PRMT家族基因在RD細(xì)胞中都有不同程度的表達(dá)，且隨著RD細(xì)胞分化時(shí)間的延長(zhǎng)

5、，表達(dá)有所增加；組蛋白精氨酸甲基化水平增加；細(xì)胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后細(xì)胞出現(xiàn)分化后的形態(tài)改變，如胞體伸長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)顆粒物增多；PRMT家族酶主要定位在胞漿中，細(xì)胞分化后進(jìn)入細(xì)胞核。
　　 二、PRMT家族酶對(duì)TPA誘導(dǎo)的RD細(xì)胞分化過(guò)程中生肌蛋白基因表達(dá)的調(diào)控作用1）構(gòu)建并驗(yàn)證了PRMT家族各成員的有效siRNA質(zhì)粒。構(gòu)建并鑒定了PRMT5、PRMT6的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pCDNA6-PRMT5（/PRMT6）-FLAG。
　　

6、 2）確定在RD細(xì)胞中，PRMT抑制劑AdOx的使用濃度為20μM。
　　 3）流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，腺苷二醛AdOx處理的RD細(xì)胞退出細(xì)胞周期，處于G2/M期阻滯狀態(tài)。WesternBlot檢測(cè)到分化標(biāo)志生肌蛋白的表達(dá)受到了明顯的抑制，說(shuō)明細(xì)胞沒(méi)有進(jìn)入分化過(guò)程。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明細(xì)胞形態(tài)上沒(méi)有明顯的分化趨勢(shì)。結(jié)果還顯示隨著TPA的誘導(dǎo)PCAF的mRNA及蛋白的表達(dá)量均明顯增加，且AdOx能明顯抑制其表達(dá)。而SWI/SNF染色

7、質(zhì)重塑復(fù)合物核心亞單位Brgl不論是在TPA誘導(dǎo)的過(guò)程中，還是AdOx處理前后都沒(méi)有明顯的改變。啟動(dòng)子活性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示TPA通過(guò)某種機(jī)制激活生肌蛋白基因的表達(dá)，而可被AdOx抑制的精氨酸甲基化作用可能是其激活途徑的必經(jīng)環(huán)節(jié)。以上AdOx處理細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，精氨酸甲基化過(guò)程是細(xì)胞分化形態(tài)的改變、主要轉(zhuǎn)錄因子活化、以及成肌相關(guān)因子激活所必需的。
　　 4）應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，經(jīng)WesternBlot實(shí)驗(yàn)證明，TPA誘導(dǎo)增

8、加的Myogenin蛋白在轉(zhuǎn)染CARM1siRNA質(zhì)粒后表達(dá)受到了明顯的抑制，PCAF的表達(dá)也有所降低。且Myogenin和PCAF的入核量也都明顯減少。過(guò)表達(dá)CARM1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Myogenin、PCAF和Brg1的核內(nèi)表達(dá)都明顯高于對(duì)照組。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了CARM1siRNA的細(xì)胞，在TPA誘導(dǎo)過(guò)程中形態(tài)上沒(méi)有明顯的分化趨勢(shì)。此外，在轉(zhuǎn)染各個(gè)PRMT特異的siRNA后，myogenin基因啟動(dòng)子活性都被明顯抑制。

9、結(jié)合上述AdOx作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，這些結(jié)果都顯示PRMT家族酶在肌肉分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 5）Myogenin基因啟動(dòng)子活性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Brgl促進(jìn)生肌蛋白表達(dá)的過(guò)程中，CARM1的作用是不可或缺的。CARM1也是PCAF增強(qiáng)生肌蛋白啟動(dòng)子活性所必需的調(diào)控因子。而p300可能與CARM1相互作用來(lái)協(xié)同增強(qiáng)myogenin啟動(dòng)子活性。
　　 三、PRMT家族酶對(duì)TPA誘導(dǎo)的RD細(xì)胞分化過(guò)程中生肌蛋白基因

10、染色質(zhì)水平的調(diào)控作用1）染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，未經(jīng)TPA誘導(dǎo)的對(duì)照RD細(xì)胞中，CARM1并不與生肌蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，TPA誘導(dǎo)3小時(shí)后，CARM1開(kāi)始結(jié)合到啟動(dòng)子上。6小時(shí)后，結(jié)合更加明顯，而SB的處理不改變CARM1的結(jié)合，說(shuō)明CARM1被募集到myogenin啟動(dòng)子上是非p38依賴性的。
　　 2）未經(jīng)處理的RD細(xì)胞生肌蛋白啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3有一定水平的乙酰化，而組蛋白H4的精氨酸甲基化水平較低，TP

11、A誘導(dǎo)后組蛋白乙?；途彼峒谆蕉济黠@升高，且經(jīng)AdOx或SB處理后都受到了抑制。
　　 3）SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞基BAF60和Brgl處理前不結(jié)合在生肌蛋白啟動(dòng)子上，TPA誘導(dǎo)后結(jié)合明顯增加，這種結(jié)合依賴于p38和精氨酸甲基化作用。
　　 4）乙酰基轉(zhuǎn)移酶p300在生理狀態(tài)下就結(jié)合在生肌蛋白的啟動(dòng)子上，TPA誘導(dǎo)和SB處理后都沒(méi)有改變，但.AdOx處理明顯抑制其結(jié)合。p300/CBP協(xié)同因子--PCA

12、F只在TPA誘導(dǎo)后結(jié)合到啟動(dòng)子上，但這種結(jié)合并不依賴于p38，而依賴于可被AdOx抑制的精氨酸甲基化作用。
　　 5）肌細(xì)胞分化調(diào)節(jié)因子MyoD不論是在TPA誘導(dǎo)前后，還是SB或AdOx處理過(guò)程中，都結(jié)合在啟動(dòng)子上且沒(méi)有明顯的改變。PRMT5生理?xiàng)l件下不結(jié)合到啟動(dòng)子上，TPA誘導(dǎo)后明顯結(jié)合，這種結(jié)合依賴于p38和精氨酸甲基化作用。
　　 6）RNA聚合酶polⅡ生理狀態(tài)下在生肌蛋白啟動(dòng)子上有一定的結(jié)合，TPA誘導(dǎo)后結(jié)合增