基于乙腦病毒2’-O甲基轉(zhuǎn)移酶的靶向減毒機(jī)制研究.pdf

1、乙型腦炎病毒屬于黃病毒科，黃病毒屬，主要由蚊蟲傳播，臨床上可以引起嚴(yán)重的病毒性腦炎癥狀。乙型腦炎主要流行于東南亞地區(qū)，但近些年來該病的流行區(qū)域不斷擴(kuò)大，現(xiàn)已擴(kuò)展到日本和澳大利亞等地區(qū)。全球每年約有35，000～50，000乙腦病例報告，其中約10，000～15，000人死亡，幸存者中約30％～50％的病人留下不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和認(rèn)知障礙等精神疾病。盡管目前針對乙型腦炎病毒有相應(yīng)的疫苗進(jìn)行接種預(yù)防，但它的高致死性及區(qū)域擴(kuò)散性依然引起國際

2、社會的廣泛關(guān)注。
　　乙型腦炎病毒為單股正鏈RNA病毒，基因組長度約為11，000nt，包括5'非編碼序列(5'NCR)，3'非編碼序列(3'NCR)和中間的單一開放閱讀框(ORF)。ORF可以編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白C，prM，E以及七種非結(jié)構(gòu)蛋白NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B和NS5。病毒基因組5'端有I型帽子結(jié)構(gòu)(m7GpppAmG)但是其3'端缺少多聚腺苷酸poly(A)尾巴。帽子結(jié)構(gòu)對于mRNA的轉(zhuǎn)運，翻

3、譯以及穩(wěn)定性至關(guān)重要。
　　mRNA的加帽過程一般需要四種酶，分別是RNA三磷酸酶，鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶，N7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶。由于黃病毒在宿主細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制，不能利用宿主的N7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶，因此進(jìn)化出了自己的甲基轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)。黃病毒NS5蛋白的N端具有甲基轉(zhuǎn)移酶活性，可以催化病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)的N7和2'-O甲基化。目前對于黃病毒甲基轉(zhuǎn)移酶以及病毒RNA帽子甲基化的了解主要來自于對西尼羅病毒和登革病毒的研究，但是乙型腦炎病毒的相

4、關(guān)研究卻較為滯后，其甲基轉(zhuǎn)移酶體外活性分析方法也尚未建立。因此本研究的目的是建立乙腦病毒N7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶體外活性分析體系，并篩選出對甲基轉(zhuǎn)移酶活性具有影響的關(guān)鍵位點，進(jìn)而測定2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失對于病毒生物學(xué)特征的影響，最后探索將2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺陷型乙腦病毒作為減毒活疫苗候選株的可行性。
　　1.乙腦病毒甲基轉(zhuǎn)移酶體外活性分析方法的建立及酶活性關(guān)鍵位點篩選
　　為了建立乙腦病毒甲基轉(zhuǎn)移酶體外活性分析方法

5、，首先我們在大腸桿菌中重組表達(dá)并純化了乙腦病毒的甲基轉(zhuǎn)移酶蛋白，純化后的重組蛋白大小約為35kDa，純度大于95％。然后我們通過PCR和體外轉(zhuǎn)錄獲得乙腦病毒5'UTR起始190nt的pppA-RNA，將其作為加帽反應(yīng)的底物。繼而利用牛痘病毒的加帽酶系統(tǒng)對pppA-RNA進(jìn)行加帽，獲得G*pppA-RNA或者m7G*pppA-RNA（*表示后面的第一個P被放射性標(biāo)記）分別作為N7和2'-O甲基化反應(yīng)的底物。在登革病毒甲基轉(zhuǎn)移酶活性測定方法

6、的基礎(chǔ)上，我們對乙腦病毒RNA的N7和2'-O甲基化反應(yīng)的鹽離子濃度，溫度，時間等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了測定乙腦病毒N7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶體外活性的最佳反應(yīng)條件和分析方法。在此基礎(chǔ)上，我們通過定點突變的方法測定NS5蛋白K61-D146-K182-E218四分體氨基酸位點突變對于乙腦病毒N7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能的影響。結(jié)果顯示，乙腦病毒NS5蛋白的K61A，D146A，K182A，E218A位點突變均會完全破壞2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能

7、，而對于N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性，除D146A完全破壞外，其它三個突變位點K61A，K182A和E218A均保留了部分N7甲基轉(zhuǎn)移酶活性。這些結(jié)果表明K61，D146，K182和E218位點對于乙腦病毒2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶執(zhí)行其功能是必需的，而D146對N7甲基轉(zhuǎn)移酶執(zhí)行其功能是必需的。
　　2.2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失對乙腦病毒生物學(xué)特征的影響
　　為了研究2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能的缺失對于乙腦病毒生物學(xué)特征的影響，我們通過定點突

8、變的方法將K61A，D146A，K182A和E218A分別引入到乙腦病毒全長感染性克隆的質(zhì)粒上，經(jīng)線性化和體外轉(zhuǎn)錄后，我們將病毒轉(zhuǎn)錄體RNA轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，最終獲得了K61A和E218A兩株2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺陷型重組乙腦病毒(D146A，K182A致死)。進(jìn)而，我們測定了突變型和野生型乙腦病毒的生物學(xué)特征，包括病毒蛋白的表達(dá)，噬斑形態(tài)，在細(xì)胞上的增殖特征，基因組的遺傳穩(wěn)定性，在小鼠中的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力以及對干擾素和IFI

9、T(IFNinducedproteinswithtetra-tricopeptiderepeats)的敏感性等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染等量病毒RNA的BHK-21細(xì)胞中，突變病毒E蛋白的表達(dá)水平與野生型相當(dāng);突變病毒的噬斑遠(yuǎn)小于野生型;突變病毒在多種細(xì)胞系中均可以良好的復(fù)制，復(fù)制效率略低于野生型;突變病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性;突變病毒在小鼠上喪失神經(jīng)侵襲力，并且神經(jīng)毒力較野生型病毒明顯降低;小鼠感染突變病毒后無病毒血癥出現(xiàn)，同時突變病毒在小鼠

10、顱內(nèi)的復(fù)制效率降低;突變病毒在神經(jīng)細(xì)胞上的增殖能力與野生型相比降低;機(jī)制上，我們發(fā)現(xiàn)突變病毒對干擾素和IFIT的抗病毒作用與野生型病毒相比更為敏感。綜上，2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失使乙腦病毒顯示出良好的減毒特征，而這種減毒特征可能與突變病毒對宿主干擾素以及IFIT的抗病毒作用更為敏感有關(guān)。
　　3.2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺陷型乙腦病毒的免疫原性和免疫保護(hù)性研究
　　為了探索將2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺陷型乙腦病毒作為減毒活疫苗

11、候選株的可行性，我們繼而對其免疫原性和免疫保護(hù)性進(jìn)行了研究。將104PFU的重組突變病毒以皮下注射方式免疫BALB/c小鼠，在免疫后的二周和四周分別采血并測定血清中IgG抗體及JEV特異性中和抗體水平，同時測定誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞免疫水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單次免疫即可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的IgG抗體以及JEV特異的中和抗體，其中免疫四周后的中和抗體滴度高達(dá)1∶97。同時脾細(xì)胞增殖和IFN-γ產(chǎn)生實驗結(jié)果說明，重組病毒免疫還可以誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的細(xì)胞免疫。

12、為了驗證免疫的效果，我們用致死劑量的異型的野生型乙腦病毒感染免疫后的小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBS對照組的小鼠全部死亡，而重組突變病毒免疫組的小鼠全部存活。這說明2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺陷型乙腦病毒單次免疫即可對小鼠產(chǎn)生完全保護(hù)。
　　綜上所述，本研究建立了乙型腦炎病毒N7和2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶體外活性分析體系，在此基礎(chǔ)上測定了保守關(guān)鍵位點突變對甲基轉(zhuǎn)移酶功能的影響以及2'-O甲基轉(zhuǎn)移酶功能缺失對于病毒生物學(xué)特征的影響。這些研究完善了我們對