水皰性口炎病毒甲基轉(zhuǎn)移酶功能位點研究.pdf

1、水皰性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)能夠?qū)RNA進行加工，包括加帽、甲基化和聚腺苷酸化。病毒mRNA的甲基化對于mRNA的穩(wěn)定和病毒蛋白的翻譯十分重要。單節(jié)段負鏈RNA病毒具有獨特的mRNA帽甲基化機制。水皰性口炎病毒L蛋白第Ⅵ功能域，具有g(shù)uanine-N-7(G-N-7)和ribose2'-O(2'-O)甲基轉(zhuǎn)移酶催化活性，而這兩個甲基轉(zhuǎn)移酶活性位點共用一個甲基供體S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點

2、。不同于常規(guī)的mRNA帽甲基化，水皰性口炎病毒2'-O甲基化過程先于G-N-7位點甲基化，且對后者有促進作用。為了完成甲基化，RNA底物必須與甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合。
　　 生物信息學分析顯示水皰性口炎病毒L蛋白第Ⅵ功能域一些高度保守的氨基酸殘基可能具有對RNA底物識別的功能。通過水皰性口炎病毒反向遺傳系統(tǒng)，應用基因定點突變對預測的RNA底物結(jié)合位點進行檢測。發(fā)現(xiàn)對氨基酸殘基位點Y1650，F(xiàn)1691和E1764的丙氨酸突變導致徹底破壞

3、G-N-7和2’-O兩個位點的甲基化。
　　 通過對Y1650和F1691兩個氨基酸位點用不同芳香氨基酸進行替換突變研究，結(jié)果表明并沒有影響甲基轉(zhuǎn)移酶活性，顯示芳香氨基酸對于RNA結(jié)合和進一步的甲基化的重要性。而VSV MTase上E1674不可替換，該位點分別以天冬氨酸(D，相同極性)，谷氨酰胺(Q，相同尺寸)和賴氨酸(K，改換極性)進行突變替換，結(jié)果表明：均明顯消減G-N-7和2’-O甲基化。
　　 三維結(jié)構(gòu)模型預測

4、顯示Y1650，F(xiàn)1691和E1764與牛痘病毒2’-O甲基轉(zhuǎn)移酶VP39上的Y22，F(xiàn)180和E233位點具有相當?shù)墓δ?。總之，我們的研究提供了以下基因和生物化學上的佐證：兩個mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶使用同一個RNA結(jié)合位點，同時，RNA底物的識別需要底物與甲基轉(zhuǎn)移酶上的芳香氨基酸相結(jié)合。
　　 之前的研究表明：重組病毒VSV-E1764A，VSV-S1827A，VSV-Y1650A和VSV-F1691A甲基化能力致弱。通過蝕斑試驗

5、和成長復制特性分析，發(fā)現(xiàn)這些重組病毒在細胞毒性上致弱。通過口腔灌服途徑將106PFU的重組病毒接種5周齡BALB/c小鼠，研究對小鼠的致病性和免疫原性。結(jié)果顯示重組病毒VSV-S1827A，VSV-Y1650A和VSV-F1691A對于小鼠致病性減弱，而VSV-E1764A仍然具有較強的致病性。免疫后的小鼠用野生型水皰性口炎病毒(VSV)進行攻毒，發(fā)現(xiàn)VSV-S1827A和VSV-Y1650A能夠誘導高水平的中和抗體，能夠保護小鼠免于攻