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1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文摘要I摘要摘要DNA甲基化作為真核生物中的一種重要表觀遺傳機(jī)制,在不同物種之間的分布模式和作用差異顯著。在真菌中,DNA甲基化在調(diào)控多種生物過程中起著重要作用,但是截止到目前真菌有性生長發(fā)育與DNA甲基化的關(guān)系尚未有研究。蛹蟲草以其易于獲得有性階段的特性,為我們研究真菌有性生長發(fā)育階段的表觀遺傳現(xiàn)象提供了寶貴資源。羅伯茨綠僵菌是研究真菌侵染昆蟲機(jī)制的一種模式系統(tǒng),同時也是化學(xué)農(nóng)藥殺蟲劑的替代品,但是目前對其DNA
2、甲基化分子機(jī)制研究甚少。本論文首先通過克隆測序、酶活測定等方法在蛹蟲草中鑒定出兩個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(CmDMTA和CmDIM2)。然后利用亞硫酸氫鹽高通量測序技術(shù)研究蛹蟲草有性階段和無性階段的DNA甲基化模式,并結(jié)合數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)研究DNA甲基化在有性生長發(fā)育中的作用。最后,對羅伯茨綠僵菌中的兩個DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MrRID和MrDIM2)進(jìn)行單敲除和雙敲除,以此來研究綠僵菌中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的功能。具體研究結(jié)果如下:(1)蛹蟲草DNA
3、甲基轉(zhuǎn)移酶的研究通過同源檢索,發(fā)現(xiàn)在蛹蟲草中存在兩個發(fā)生DNA甲基化所必需的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(CmDMTA和CmDIM2)。通過RACE及測序方法得到了CmDMTA和CmDIM2基因的全長序列,并且進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。隨后,分別構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)。SDSPAGE結(jié)果顯示,兩個重組蛋白都被成功的誘導(dǎo)表達(dá),而且Westernblot結(jié)果顯示重組蛋白都能夠被抗HIS標(biāo)簽抗體特異性識別。然后采用鎳柱純化重組蛋白,
4、獲得高純度重組蛋白。最后通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測發(fā)現(xiàn)CmDMTA和CmDIM2都具有DNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性。(2)DNA甲基化在蛹蟲草有性生長發(fā)育中的作用①DNA甲基轉(zhuǎn)移酶在蛹蟲草不同階段的表達(dá):RealtimePCR結(jié)果顯示CmDMTA和CmDIM2在蛹蟲草不同生長階段的表達(dá)變化趨勢相似。隨著分生孢子的不斷產(chǎn)生,CmDMTA和CmDIM2基因的表達(dá)量越來越高,CmDMTA和CmDIM2基因的表達(dá)量在有性階段的初期達(dá)到最高。②蛹蟲草不
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