應用釀酒酵母和畢赤酵母對水稻DNA甲基轉移酶生物學功能的初步研究.pdf

1、DNA甲基化修飾是存在于多數真核生物中的一種重要的表觀遺傳修飾,DNA甲基轉移酶系統(tǒng)在其中起著重要的作用,因此,DNA甲基轉移酶的生物學功能及其作用機制受到越來越多的關注。
　　 本研究通過生物信息學方法預測得到水稻DNA甲基轉移酶(OsDMT)編碼基因,構建水稻DNA甲基轉移酶真核表達載體,然后將其轉化到沒有DNA甲基化背景的釀酒酵母株系AH109中進行表達。同時選取人類的DNA從頭甲基化酶DNMT3A、DNMT382作為實驗

2、的陽性對照。利用梯度稀釋的點板(Dotting Assay)研究外轉基因對釀酒酵母AH109生長狀態(tài)的影響,用綠色熒光蛋白檢測外轉基因在酵母中的表達情況。結果顯示:通過菌液PCR、雙酶切鑒定及測序,得到了正確重組的pBridge DNMT3A、pBridge—DNMT382、pBridge_OsDMT、pBridge_EGFP和pBridge_OsDMT_EGFP,并成功轉化到釀酒酵母AHl09中,得到陽性單克隆。梯度稀釋的點板實驗中,

3、陽性對照組DNMT3A和DNMT382對釀酒酵母AH109產生了生長抑制,而實驗組OsDMT對釀酒酵母的生長并無明顯抑制。外轉帶有EGFP質粒和不帶EGFP質粒的菌體在藍光激發(fā)下均呈綠色,尚不確定外轉基因是否被表達。使用MSAP分子標記技術對隨機選取的單克隆個體進行全基因組范圍甲基化分析,結果顯示外轉的hDNMT3A、DNMT382和OsDMT使酵母基因組DNA甲基化升高。但也發(fā)生了極個別去甲基化的現象,這有可能是細胞分裂過程中產生的序