禽偏肺病毒mRNA甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷弱毒疫苗株的研究.pdf

1、禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus，aMPV），又稱火雞鼻氣管炎病毒（Turkeyrhinotracheitis virus，TRTV），早期稱為禽肺病毒(Avian pneumovirus，APV)，該病毒最早于1978年從南非發(fā)病火雞中分離得到，之后在世界范圍內(nèi)蔓延傳播。aMPV是副粘病毒科、肺病毒亞科、偏肺病毒屬成員，有囊膜，屬單節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒。病毒mRNA的加工處理對(duì)病毒基因的表達(dá)與病毒基因組的復(fù)制至關(guān)重

2、要，mRNA的加工處理過(guò)程包括加帽、甲基化和聚腺苷酸化。其中加帽和甲基化對(duì)mRNA的穩(wěn)定、翻譯及基因表達(dá)最為重要，這些加工過(guò)程需要一系列的酶促反應(yīng)，AMPV復(fù)制過(guò)程中的上述一系列酶促反應(yīng)均由其L蛋白負(fù)責(zé)完成。對(duì)于單股負(fù)鏈RNA病毒而言，其L蛋白包括六個(gè)高度保守的功能域，分別為CRⅠ、CRⅡ、CRⅢ、CRⅣ、CRⅤ和CRⅥ功能域。單股負(fù)鏈RNA病毒具有獨(dú)特的mRNA甲基化機(jī)制。生物信息學(xué)分析顯示，aMPV L蛋白CRⅥ功能域具有g(shù)uani

3、ne-N-7(G-N-7)和ribose2'-O(2'-O)甲基轉(zhuǎn)移酶催化活性，這兩個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶活性位點(diǎn)共用一個(gè)甲基供體S-腺苷甲硫氨酸（SAM）結(jié)合位點(diǎn)。
　　基于生物信息學(xué)分析，我們對(duì)aMPV L蛋白CRⅥ功能域預(yù)測(cè)的MTase催化位點(diǎn)及S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸定點(diǎn)突變，并運(yùn)用反向遺傳學(xué)系統(tǒng)，成功拯救了raMPV-G1696A、raMPV-G1700A、raMPV-N1701A和raMPV-D1755A四株aMPV科

4、羅拉多株(Colorado)重組病毒。體外甲基化研究結(jié)果顯示，四株重組病毒在2'-O位點(diǎn)的甲基化有明顯的消減，但在G-N-7位點(diǎn)的甲基化卻幾乎未受影響。另外，進(jìn)一步的兩步甲基化試驗(yàn)證明G-N-7位點(diǎn)的甲基化先于2'-O位點(diǎn)的甲基化且前者對(duì)后者有促進(jìn)作用。重組病毒蝕斑試驗(yàn)和生長(zhǎng)特性分析表明，四株重組病毒在細(xì)胞上培養(yǎng)時(shí)高度致弱，且保持著良好的遺傳穩(wěn)定性。
　　為進(jìn)一步驗(yàn)證aMPV甲基轉(zhuǎn)移酶缺陷株是否可以作為弱毒疫苗進(jìn)行開發(fā)，本研究開展

5、了重組病毒的動(dòng)物試驗(yàn)研究。通過(guò)點(diǎn)眼、滴鼻途徑將5×106 PFU的重組病毒接種2周齡火雞，研究重組病毒在火雞內(nèi)的致病性和免疫原性。結(jié)果顯示，四株甲基缺陷性重組病毒在火雞呼吸道內(nèi)的復(fù)制能力均降低，并且可以誘發(fā)高水平的中和抗體，可以完全保護(hù)火雞免受同源性野生型aMPV科羅拉多株(aMPV/CO)和異源性野生型aMPV明尼蘇達(dá)株（aMPVMN）的攻毒感染。
　　總之，體外試驗(yàn)顯示，缺少2'-O位點(diǎn)甲基化的重組禽偏肺病毒（raMPV），高