組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2在力達(dá)霉素等藥物誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　結(jié)腸癌(Colon cancer)是世界第三大惡性腫瘤，具有很高的發(fā)病率及死亡率。腫瘤發(fā)生的主要事件是腫瘤細(xì)胞逃逸衰老和死亡程序而進(jìn)入永生化，因此誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞重獲衰老特征及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是抑制腫瘤生長(zhǎng)和增殖的重要途徑。越來(lái)越多的研究證明，表觀遺傳調(diào)控在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶EZH2(Enhancer ofzeste homolog2)是表觀遺傳調(diào)控蛋白PRC2家族的核心成員，通過(guò)三甲基化

2、H3K27(H3K27me3)進(jìn)而發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄沉默作用。細(xì)胞衰老是公認(rèn)的抗腫瘤作用機(jī)制之一，研究發(fā)現(xiàn)，抑制EZH2的表達(dá)能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞衰老，然而，EZH2在烯二炔類(lèi)DNA損傷藥物誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞衰老中的作用至今尚不清楚。本研究選用人結(jié)腸癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，擬用高效抗腫瘤烯二炔藥物力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)觀察其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)是否有影響，以及EZH2在力達(dá)霉素誘導(dǎo)細(xì)胞衰老中的作用及機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，本研究

3、還采用EZH2抑制劑DZNep作用結(jié)腸癌細(xì)胞來(lái)觀察DZNep能否誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老。
　　方法:
　　MTT法、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定及克隆形成實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)上述藥物對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活力及克隆形成能力的影響;SA-β-Gal染色檢測(cè)細(xì)胞衰老表型;PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布;AnnexinⅤ Alexa Fluor488/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡細(xì)胞比例;雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)p21啟動(dòng)子區(qū)的活性;蛋白免疫印跡和實(shí)時(shí)熒

4、光定量PCR檢測(cè)各蛋白水平和mRNA水平的變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX的含量變化;免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)人結(jié)腸癌組織樣本中EZH2和細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p21的表達(dá);siRNA敲低EZH2表達(dá)以及構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體過(guò)表達(dá)EZH2，檢測(cè)其對(duì)LDM所致細(xì)胞增殖、周期及衰老作用的影響。siRNA敲低p21表達(dá)，檢測(cè)對(duì)LDM誘導(dǎo)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞衰老作用的影響。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EZH2蛋白與p21啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合作用。

5、r>　　結(jié)果:
　　一、EZH2與LDM誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞衰老的關(guān)系研究
　　LDM對(duì)HCT116和SW620細(xì)胞有明顯抑制增殖活力及克隆形成能力的作用。SA-β-Gal染色觀察到IC50濃度范圍(0.5 nM) LDM作用48 h-120h可以明顯誘導(dǎo)HCT116和SW620細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老，并且該衰老樣表型具有不可逆性。0.5 nMLDM作用時(shí)間依賴(lài)性誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期周期阻滯及細(xì)胞凋亡，同時(shí)DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX含

6、量明顯增加。LDM可明顯抑制EZH2、H3K27me3及PRC2成員蛋白的表達(dá)水平并上調(diào)衰老相關(guān)蛋白p21的表達(dá)水平，其中對(duì)EZH2、H3K27me3及PRC2成員蛋白的抑制作用具有劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性;LDM對(duì)EZH2蛋白表達(dá)的抑制作用與其mRNA水平變化有關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LDM可顯著增加p21啟動(dòng)子區(qū)的活性。siRNA敲低EZH2表達(dá)后可誘導(dǎo)上述細(xì)胞發(fā)生衰老及G2/M細(xì)胞周期阻滯等類(lèi)似現(xiàn)象。免疫組化結(jié)果顯示EZH2在

7、人結(jié)腸癌癌組織中的表達(dá)普遍高于癌旁組織。通過(guò)在HCT116細(xì)胞中過(guò)表達(dá)EZH2，LDM對(duì)p21啟動(dòng)子的激活作用和p21蛋白表達(dá)上調(diào)作用均受到抑制，DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX含量下降。siRNA敲低p21的表達(dá)可顯著逆轉(zhuǎn)LDM誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果顯示，LDM作用SW620細(xì)胞72 h后能夠顯著降低EZH2及H3K27me3在p21啟動(dòng)子區(qū)的富集。
　　二、DZNep誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞衰老的機(jī)制研究

8、r>　　DZNep在IC50范圍內(nèi)(5μM)對(duì)HCT116細(xì)胞有明顯抑制增殖活力及克隆形成能力的作用。SA-β-Gal染色觀察到DZNep(5μM)作用48 h-120 h能夠誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，同時(shí)通過(guò)siRNA干擾EZH2的表達(dá)也能觀察到衰老染色陽(yáng)性細(xì)胞。5μMDZNep作用24 h-72 h能夠誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M周期阻滯及細(xì)胞凋亡。DZNep作用48h-120 h能夠時(shí)間依賴(lài)性抑制EZH2、EED、SUZ12蛋白表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白

9、p21、p27蛋白表達(dá)，并下調(diào)p-RB和p-cdc2蛋白的表達(dá)。Western Blot檢測(cè)到凋亡標(biāo)志蛋白PARP切割。
　　結(jié)論:
　　本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌細(xì)胞中LDM能夠抑制EZH2及其他PRC2家族成員以及甲基化組蛋白H3K27me3的表達(dá)，證明了LDM通過(guò)抑制EZH2的表達(dá)，解除對(duì)p21啟動(dòng)子區(qū)的抑制作用并上調(diào)p21蛋白的表達(dá)，激活細(xì)胞衰老信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞衰老。而在EZH2抑制劑DZNep抑制結(jié)腸