力達霉素對不同p53基因型人結腸癌細胞的作用機制.pdf

1、本論文系統(tǒng)的探討了LDM對表達不同p53基因的人結腸癌細胞中的作用中，以及LDM對人結腸癌細胞作用的劑量依賴性、p53依賴性和非依賴性。 1.LDM對不同p53基因型人結腸癌細胞作用的劑量依賴性和p53依賴性。結腸癌細胞在所有的人腫瘤細胞基因表達中具有很高的突變性和復雜性。P53在許多主要組織來源的腫瘤中均發(fā)生了不同程度的突變，其中腸癌的突變率大約是60％<'(1)>。為了評價不同p53基因型人結腸癌細胞對LDM反應的特點，將表

2、達不同p53基因型的人結腸癌細胞(包括p53野生型、p53突變型和p53敲除型)作為研究對象，考察了LDM對其作用特點。用MTT法檢測LDM對人結腸癌細胞作用24h的生長抑制作用、用流式細胞儀分析凋亡相關的亞G1峰比例。MTT結果表明：LDM對人結腸癌細胞的生長抑制作用呈現顯著的劑量相關的p53依賴性：在10 nM水平，LDM對p53野生型的結腸癌細胞(包括：HCT116，LOVO，COLO205)的生長抑制作用(范圍在50-70％之間

3、)比p53突變型結腸癌細胞(包括HCT15，HT29，SW620和SW480)更高(大約在10-25％之間)；然而，當細胞用1μM劑量的LDM處理后，則失去了這種p53依賴性，即兩類表達不同p53基因的細胞死亡的比例接近(>60％)。流式細胞儀分析LDM作用于結腸癌細胞的亞G1峰比例，結果趨勢與MTT相似。 2.LDM對HCT116細胞作用的p53依賴性和非依賴性。為了深入探討p53在LDM對人結腸癌細胞的作用中所發(fā)揮的作用，采

4、用一對表達不同p53基因型的人結腸癌HCT116細胞作為主要研究對象，其中母本細胞是HCT116 p53 wt(p53野生型)細胞，表達野生型p53基因，另一種細胞是用同源重組的方法將p53基因從HCT116母本細胞中敲除后的HCT116 p53 ko細胞(p53敲除型)<'(2)>。HCT116細胞是一種錯配缺失的腫瘤細胞，基因表達穩(wěn)定且很少分化<'(3)>，其p53基因是野生型的，對外界刺激比較敏感。LDM作用于HCT116 p53

5、wt和p53 k0細胞24h后，分別用MTT和流式細胞儀檢測LDM的生長抑制作用和亞G1峰比例。結果表明，在10 nM水平，LDM。的生長抑制作用呈現顯著p53依賴性和時間依賴性，即LDM對p53野生型HCT116細胞對的生長抑制作用比p53敲除型細胞明顯(具有統(tǒng)計學差異，p<0.05)，而在100-1000 nM水平，兩種細胞經LDM處理后早在6h即出現顯著的生長抑制，且比例接近，這說明在HCT116細胞中，高劑量的LDM對HCT11

6、6細胞的生長抑制作用不依賴p53，該結果與FACS的結果一致。Western blot檢測p53和p21蛋白表達情況，10 nM LDM能時間依賴的誘導野生型細胞中p53活性增加，且對p53的誘導作用發(fā)生在早期(給藥后0.5h即能檢測到)，相比之下，對照藥MMC 30μM作用后12h才檢測到對p53的誘導作用。P21作為p53功能性升調節(jié)的下游蛋白表達也隨之增加。P53敲除型細胞中雖然不表達p53，但在10 nM LDM作用下有大約15

7、％的細胞凋亡，這說明低劑量LDM作用通過p53非依賴的方式誘導凋亡。相比之下，高劑量LDM(1μM)對HCT116細胞中p53和p21的蛋白表達沒有影響，這說明高劑量LDM的作用不通過p53依賴通路介導。流式細胞儀檢測凋亡相關的亞G1峰比例，5-Fu在375μM濃度時對HCT116細胞的作用與LDM相似，也具有p53依賴性，p53野生型：HCT116細胞對5-Fu更敏感。MTT法檢測LDM和幾種常見抗腫瘤藥物的IC50值，包括5-氟尿嘧

8、啶(5-Fu)、絲裂霉素C(MMC)、紫杉醇和阿霉素等。結果表明LDM的IC50值比其它幾種藥物至少低3個數量級。LDM、5-Fu和MMC對p53野生型細胞的IC50值低于p53敲除型細胞，紫杉醇對兩種細胞的IC50值沒有顯著差別，而p53敲除型細胞相對于野生型細胞對阿霉素更敏感，這說明紫杉醇和阿霉素可能存在其它獨特的不依賴于p53活性的作用機制。 以前的研究表明，LDM的作用原理與對染色質DNA的切割有關。為了進一步驗證LDM

9、的作用方式，用DNA特異性熒光染料Hoechst 33342對LDM作用后的HCT116細胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察并記錄染色質的凝集特點。10 nMLDM處理HCT116細胞24h，觀察到大部分細胞為典型的凋亡式染色質凝集，細胞核固縮呈塊狀，細胞形態(tài)變小，出現凋亡小體等，p53 wt細胞凋亡小體的數目顯著多于p53 ko細胞，絲裂霉素(MMC)作為陽性對照藥，在30μM濃度時，也能誘導HCT116細胞出現依賴于p53的典型凋亡特征；

10、與之凋亡形成鮮明對照的是，1 μM LDM處理后的：HCT116細胞出現一種異型的染色質凝集方式，該染色質凝集的特征為：核膜一直保持完整，染色質既沿核膜邊緣凝集，又在細胞核中間凝集，呈散點狀分布，細胞仍貼壁，不漂浮到培養(yǎng)基中；死亡后期不形成凋亡小體，最后細胞崩解；染色質凝集出現的時間較短(大約2小時)，不像細胞凋亡那樣需一個較長的時間(>12h)，這種特別的染色質凝集方式與。p53的表達與否無關。這說明高劑量LDM可能通過快速直接切割染

11、色質。DNA而發(fā)揮其高效抗腫瘤作用。TUNEL染色法觀察LDM作用后HCT116兩種細胞死亡的狀態(tài)，與染色質凝集的結果一致。瓊脂糖凝膠電泳對LDM作用后的HCT116細胞基因組。DNA進行電泳，在10 nM水平，LDM對DNA的切割具有p53依賴性，p53 wt細胞中出現DNA梯帶的時間(4h)早于p53 ko細胞(12h)，而在高劑量時(1 μM)，LDM處理15分鐘時即可觀察到明顯的DNA梯帶出現，LDM作用1h后出現大量的DNA梯

12、帶，在兩種細胞中這種強烈的DNA斷裂作用沒有區(qū)別，這表明1 μM LDM對DNA的切割是非p53依賴性的，這也與染色質凝集和TUNEL的結果相吻合。 3．低劑量LDM誘導HCT116細胞凋亡主要通過線粒體途徑。線粒體通路與細胞凋亡和DN_A的損傷反應密切相關<'(4)>，是p53介導凋亡發(fā)生的主要途徑<'(5-7)>。我們用流式細胞儀檢測了線粒體通路的主要指標線粒體膜電位(△Ψm)的變化<'(8)>，結果表明：10 nM LDM

13、作用后△Ψm降低時間早于DNA斷裂時間，p53 wt細胞的△Ψm下降程度比p53 ko型細胞更顯著，表明10 nM LDM對△Ψm的作用具有p53依賴的特點；而1μM LDM對線粒體膜電位沒有顯著影響，因此推測高劑量的LDM的作用可能不通過線粒體途徑。線粒體通路的另一個重要的檢測指標是活性氧(ROS)的水平，ROS在p53誘導凋亡過程中的激活通常發(fā)生在△Ψm的上游<'(9)>。在p53 wt細胞中，觀察到10 nM LDM處理后ROS的

14、顯著升高，p53 ko細胞的ROS也有少許升高；caspase-9在線粒體凋亡途徑中是一個關鍵性蛋白，通過與細胞色素c和Apaf-1形成凋亡復合物而發(fā)揮誘發(fā)凋亡的作用<'(4)>，在p53 wt細胞中，檢測到caspase-9表達水平升高，還檢測到具有執(zhí)行凋亡功能的caspase-3，6和7以及PARP的激活，PARP從116kDa的大片斷被切割成具有生物活性的89kD亞基，進而誘發(fā)凋亡。在p53 ko細胞中以上線粒體通路相關的casp

15、ase家族蛋白和PARP也都被激活，但激活的程度不如p53 wt細胞，這證明p53在線粒體途徑中起誘導作用。在1 μM LDM作用下，HCT116細胞中的caspase未被激活，有趣的是PARP被切割，與p53的狀態(tài)無關，但不是被切割成具有生物活性的89KD大片斷，這說明1μM LDM的作用不是通過典型的線粒體途徑發(fā)揮作用，可能存在其它獨特的作用機制。 4.Bcl-2家族在LDM誘導的細胞凋亡中的作用。Bcl-2家族的促凋亡蛋白

16、PUMA、Bax、P-Bad、Bak、Bim在HCT116 p53 wt細胞經10 nM LDM作用后的表達水平時間依賴的升高，這表明LDM激活了Bcl-2家族中的促凋亡蛋白；而在p53 ko細胞中，只有PUMA的表達水平出現少量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2在兩種細胞中的表達沒有顯著變化，說明p53在凋亡中發(fā)揮主導性作用，而抗凋亡蛋白Bcl-2在凋亡過程中的作用并非主導性的；對于1μM劑量LDM的作用，這些與典型凋亡的線粒體途徑相關的蛋白

17、表達在兩種細胞中都沒有出現顯著的變化，這說明高劑量LDM作用不激活Bcl-2家族。 分別用MTT法和FACS法檢測了LDM對p53基因敲除(p53-/-)、PUMA基因敲除(PUMA-/-)和Bax基因敲除(Bax-/-)后的HCT116細胞的作用，發(fā)現同樣在10 nM水平，PUMA-/-和Bax-/-型HCT116細胞與p53-/-細胞具有相似的抗凋亡作用，提示LDM誘導凋亡可能與這兩個基因有關。而在更高濃度LDM(100-1