人Ⅰ型丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶原核表達(dá)、表位分析及其抗體制備.pdf

1、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase)俗稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶,它是糖異生和氨基酸代謝過程中一個(gè)至關(guān)重要的酶,主要分布在肝臟組織中。當(dāng)肝組織損傷因?yàn)椴《拘愿窝?、非酒精性脂肪肝、肝硬化及藥物因素?fù)p傷時(shí),肝細(xì)胞中的ALT釋放入血,使血清中ALT顯著增高。因此,在過去的50多年間,臨床上一直把血清中ALT作為反映肝功能的一個(gè)重要的生物標(biāo)志物。通過對(duì)血清中ALT的檢測(cè),可以反映出肝臟功能是否損傷以及損傷的程度。
　　

2、 近年來發(fā)現(xiàn)人體中ALT有3種同功酶,ALT1、ALT2和ALT2-20實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),ALT1與ALT2有著共同的催化活性,而ALT2-2未發(fā)現(xiàn)有催化活性。ALT1主要分布在肝臟、骨骼肌和腎臟組織中,亞細(xì)胞定位于胞漿和內(nèi)質(zhì)網(wǎng);ALT2主要分布在心肌細(xì)胞和骨骼肌中,而在肝臟和腎臟組織中未見表達(dá),亞細(xì)胞定位于線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),在胞漿中不存在。因此,血清中ALT1水平比總ALT能更特異的反應(yīng)肝臟功能狀態(tài)。
　　 目前,臨床上對(duì)ALT的檢

3、測(cè)主要是通過檢測(cè)總的ALT酶活性來完成的。這種方法雖然操作相對(duì)簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確,但要依賴常規(guī)的生化檢測(cè)儀器,不能滿足在獻(xiàn)血現(xiàn)場(chǎng)對(duì)獻(xiàn)血員ALT的快速篩查。
　　 我們擬建立基于免疫學(xué)診斷技術(shù)的檢測(cè)方法,對(duì)血清中ALT1的實(shí)際含量進(jìn)行快速檢測(cè),以滿足獻(xiàn)血現(xiàn)場(chǎng)對(duì)血源篩查的需要,并且可以更準(zhǔn)確、特異地反應(yīng)肝臟功能。為進(jìn)一步研發(fā)ALT1免疫學(xué)體外診斷試劑奠定基礎(chǔ)。本課題擬制備出ALT1特異的抗體。
　　 目的:
　　 原核表

4、達(dá)截短的ALT1蛋白,用它免疫新西蘭大白兔后,制備出特異的ALT1多克隆抗體;用合成的表位肽免疫BALB/c小鼠,制備特異的ALT1單克隆抗體。為研發(fā)ALT1免疫學(xué)體外診斷試劑奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建ALT1截短表達(dá)載體pCold-TF-ALT1。
　　 2.將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)表達(dá)宿主菌,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及SDS-PAGE分析表達(dá)形式后,用鎳離子親和層析法純化融合蛋白

5、,再經(jīng)HRV-3C蛋白酶酶切后,應(yīng)用凝膠過濾法去除標(biāo)簽蛋白,進(jìn)而得到不帶標(biāo)簽的截短ALT1蛋白。
　　 3.通過B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)軟件分析ALT1的抗原表位,綜合分析后,選取兩段肽MC-15和CK-17交予公司合成,并分別偶聯(lián)KLH以增加免疫原性。
　　 4.用純化的截短ALT1蛋白免疫新西蘭大白兔,制備ALT1多克隆抗體。
　　 5.用人工合成偶聯(lián)有KLH的MC-15、CK-17表位肽分別免疫BALB/c小鼠,

6、通過雜交瘤技術(shù)制備ALT1單克隆抗體。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功構(gòu)建ALT1的截短表達(dá)質(zhì)粒,通過PCR和雙酶切鑒定得到與預(yù)期大小一致的基因片段,同時(shí)通過基因測(cè)序分析證實(shí)完全一致,并無移碼突變。
　　 2.通過鎳離子親和層析純化后得到較純的重組截短表達(dá)蛋白,融合蛋白再通過HRV-3C蛋白酶酶切后經(jīng)分子篩純化得到不帶標(biāo)簽的目的蛋白。
　　 3.用純化的ALT1截短表達(dá)蛋白免疫新西蘭大白兔后,制備出了特異性

7、好、效價(jià)高的ALT1多克隆抗體。
　　 4.用人工合成偶聯(lián)有KLH的MC-15、CK-17表位肽免疫BALB/c小鼠,建立了多株穩(wěn)定分泌ALT1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,通過腹水誘生法制備了腹水型ALT1單克隆抗體,間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法證明了腹水效價(jià)可達(dá)106,并可識(shí)別人血清中的ALT1蛋白。
　　 結(jié)論:
　　 重組表達(dá)的截短融合蛋白經(jīng)鎳離子親和層析純化后,得到的融合蛋白再通過HRV-3C蛋白酶酶切后應(yīng)用分子