基于蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選的日本血吸蟲鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和親免素的克隆表達(dá)及其診斷應(yīng)用.pdf

1、目的：為尋找新的血吸蟲病免疫診斷候選抗原分子,對(duì)基于蛋白質(zhì)組技術(shù)篩選出的日本血吸蟲鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(SjOAT)和親免素(SjIP)進(jìn)行體外重組表達(dá)、純化。通過初步的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)評(píng)估重組蛋白rSjOAT和rSjIP在日本血吸蟲病免疫診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：以日本血吸蟲成蟲cDNA為模板,體外擴(kuò)增SjOAT和SjIP目的基因,以pET28a為載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌系統(tǒng)中;異丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá),優(yōu)化

2、重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)條件;大量誘導(dǎo)表達(dá)后,應(yīng)用Ni2+親和層析法純化rSjOAT、rSjIP;SDS-PAGE和Western blotting驗(yàn)證表達(dá)量和免疫活性。應(yīng)用重組抗原間接ELISA診斷日本血吸蟲病,并與日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)的間接ELISA平行檢測(cè),比較兩種方法之間的敏感性、特異性和交叉反應(yīng)性的差異。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了表達(dá)型重組質(zhì)粒pET28a/SjOAT和pET28a/SjIP,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng),證實(shí)構(gòu)

3、建的兩種質(zhì)粒均能表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析可見相對(duì)分子質(zhì)量約50KDa和55KDa處有SjOAT、SjIP融合蛋白的表達(dá);Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明rSjOAT、rSjIP能被抗His-tag單克隆抗體、血吸蟲病患者血清識(shí)別。純化后的SjOAT蛋白濃度達(dá)0.5㎎/ml,純化后的SjIP蛋白濃度達(dá)1.3㎎/ml。分別以兩種重組抗原建立間接ELISA法檢測(cè)急、慢性血吸蟲病患者血清結(jié)果顯示:rSjOAT對(duì)52份急性血吸蟲

4、患者血清、81份慢性血吸蟲病患者血清的敏感性分別達(dá)到了90.4％和86.4%;檢測(cè)94例正常對(duì)照者血清的假陽(yáng)性率為1.1%;檢測(cè)94例疫區(qū)糞檢陰性者血清的陽(yáng)性率為3.2%。rSjIP對(duì)上述急、慢性血吸蟲病患者血清的敏感性分別達(dá)到了88.5%、79.0%;對(duì)上述正常對(duì)照者血清假陽(yáng)性率為2.1%;對(duì)上述疫區(qū)糞檢陰性者血清的陽(yáng)性率為4.3%。將上述急、慢性血吸蟲病患者血清以SEA-ELISA檢測(cè),敏感性分別為94.2%和82.7%。SEA-E

5、LISA檢測(cè)上述正常對(duì)照者血清、疫區(qū)糞檢陰性者血清的陽(yáng)性率為9.6%和12.8%。兩種重組抗原的敏感性分別與SEA的敏感性相比較,差異無顯著性(P＞0.05),而特異性比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。rSj-ELISA和SEA-ELISA分別檢測(cè)22份華支睪吸蟲、36份并殖吸蟲、26份鉤蟲感染者血清時(shí),交叉反應(yīng)性的比較顯示無顯著性差異。
　　結(jié)論：本研究成功克隆、表達(dá)了基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)從日本血吸蟲成蟲中篩選出的SjOAT和S