人Ⅰ型丙氨酸氨基轉移酶抗體的制備及生物學特性研究.pdf

1、人Ⅰ型丙氨酸氨基轉移酶是人體內一種以磷酸吡哆醛為輔基的氨基轉移酶，在體內催化氨基在丙氨酸和谷氨酸之間轉移，在非必需氨基酸的合成和蛋白質分解代謝中起重要的中介作用。臨床上ALT是反應肝臟功能的有效指標。血清中ALT的活性可有意義地評估由感染、藥物、酒精及脂肪變性等原因而引起的肝臟損害，對肝臟疾病的診斷，鑒別診斷及病情和療效的監(jiān)測方面發(fā)揮著重要作用。目前，ALT在臨床上的檢測方法是利用血清中的丙氨酸氨基轉移酶，在一定條件下催化底物L-丙氨酸

2、與α-酮戊二酸生成L-谷氨酸和L-丙酮酸，再針對該反應產物偶聯(lián)一個指示反應，計算出ALT酶活性濃度。此類方法檢測的均是ALT酶活性濃度而不是血清中ALT的質量濃度。酶活性測定方法影響因素多，易受底物濃度、酶蛋白抑制劑、離子強度、pH、溫度等多種因素的影響，同時不能有效區(qū)分不同的同功酶，因此有必要建立特異的免疫學方法來監(jiān)測血清中丙氨酸氨基轉移酶中實際質量，從而更加真實客觀地反應肝臟功能的損害程度。 目的： 構建人Ⅰ型丙氨酸

3、氨基轉移酶（ALT1）的原核表達載體，用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗ALT1多克隆抗體，同時用純化的ALT1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，制備特異性針對ALT1的單克隆抗體，為進一步建立ALT1的免疫學診斷方法和研究ALT1的生物學作用和機制奠定基礎。 方法： 1.采用RT-PCR法擴增ALT1基因片段，并將其分別克隆到原核表達載體pET32a（+）和pGEX-4T-2，構建人Ⅰ型丙氨酸氨基轉移酶（AL

4、T1）的原核表達載體。 2.將構建的重組表達質粒轉化表達宿主菌BL21（DE3），經IPTG誘導表達，對表達蛋白進行SDS-PAGE電泳分析和Western Blot檢測，采用親和層析純化融合蛋白。 3.用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔，制備抗ALT1的多克隆抗體。 4.用純化的ALT1重組蛋白免疫Balb/c小鼠，制備特異性針對ALT1的單克隆抗體。 結果： 1.用RT-PCR方法擴增出

5、與預期大小一致的目的基因片段，目的基因與載體連接后的重組質粒經雙酶切鑒定及測序分析證實重組質粒構建成功。 2.經重組表達純化，獲得了ALT1融合蛋白，其在pET32a（+）/ALT1表達載體中表達形式為不溶性包涵體，在pGEX-4T-2/ALT1載體中有少部份以可溶性形式表達，融合蛋白均能通過親和層析的方法純化。 3.用純化的ALT1重組蛋白免疫新西蘭大白兔，可制備出特異性針對ALT1的多克隆抗體。 4.用純化的

6、ALT1可溶性重組蛋白免疫Balb/c小鼠，建立了穩(wěn)定分泌抗ALT1的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為8A9。其抗體亞類為IgG2；將8A9細胞株接種到預處理的Balb/c小鼠腹腔中制備腹水型ALT1單克隆抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）證明腹水效價可達l05；Western Blot結果鑒定提示該單克隆抗體可以特異性結合ALT1。 結論： 經基因重組技術獲得ALT1融合蛋白，并對其進行了純化，制備了特異性針對ALT