丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶單克隆抗體的制備及鑒定.pdf

1、研究背景：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是人血清中的一種重要的催化酶，在蛋白質(zhì)分解代謝中起氨基轉(zhuǎn)移作用。它主要存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)，肝細(xì)胞損傷時(shí)，大量的ALT釋放入血，所以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是反映肝損傷的敏感的指標(biāo)。為減少輸血傳播疾病的發(fā)生，我國衛(wèi)生部規(guī)定，血清ALT檢驗(yàn)是獻(xiàn)血員健康體檢必查項(xiàng)目之一，而我國每年由于ALT不合格造成的采血后血液報(bào)廢率達(dá)6-8％。面對現(xiàn)在街頭無償獻(xiàn)血者因血清ALT高造成大量不必要的獻(xiàn)血和血液浪費(fèi)問題，非常有必要建立一種快速靈敏

2、、準(zhǔn)確方便的ALT檢測方法。目前街頭獻(xiàn)血者ALT的篩查均采用速率法和化學(xué)干粉法。但這兩種方法存在的主要問題是反應(yīng)時(shí)間長，需要特殊設(shè)備，受環(huán)境因素影響大。免疫金標(biāo)法具有操作簡便、快速、特異性強(qiáng)，不需要特殊設(shè)備，易觀察結(jié)果等優(yōu)點(diǎn)，因此我們探索ALT免疫金標(biāo)快速檢測試劑的研制，而高特異性抗ALT單克隆抗體的制備是該試劑研制的關(guān)鍵步驟。 目的：獲得分泌高特異性抗ALT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；制備針對ALT的單克隆抗體并對其特性進(jìn)行鑒定

3、。 方法：用含50％福氏佐劑的豬TLT純品(20μg)腹部皮下免疫Balb/C小鼠，共4次，免疫間隔為2周。間接ELISA法測抗體效價(jià)。取效價(jià)滿意鼠的脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用含HAT和HT的培養(yǎng)液選擇性培養(yǎng)，用高ALT人血清作檢測原，采用間接ELISA法測定培養(yǎng)上清中抗體分泌情況，陽性孔經(jīng)三次有限稀釋法克隆化，得到的陽性雜交瘤細(xì)胞株腹腔接種于預(yù)注射降植烷的Balb/C小鼠，收集腹水，用正辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行純化

4、。 采用間接ELISA法測定腹水中效價(jià)和親和力：秋水仙素阻斷法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體分析；用SouthernBiotech公司的單克隆抗體亞類鑒定試劑鑒定單抗亞類；SDS-PAGE電泳測定單抗的分子量；用Westernblotting分析單克隆抗體的特異性；將純化后單抗用辣根過氧化物酶標(biāo)記，建立雙抗體夾心ELISA檢測人血清中的ALT的方法。 結(jié)果：采用傳統(tǒng)的細(xì)胞融合技術(shù)得到1株分泌抗人ALT單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其染

5、色體數(shù)目為95～106。其分泌的抗體為IgG1，輕鏈為κ型。上清和腹水中抗體效價(jià)分別為10-4和10-6。SDS-PAGE顯示該抗體在55KD和25KDWesternblotting結(jié)果顯示該株McAb可與人血清中的ALT特異地結(jié)合。人血清標(biāo)本和ALT質(zhì)控品的雙抗體央心ELISA結(jié)果和生化分析儀結(jié)果基本一致。 結(jié)論：本研究獲得了一株能穩(wěn)定分泌ALT單克隆抗體特異性的雜交瘤細(xì)胞株，該株單抗有很好的親和力，能特異性地識別人血清中的A