酶法生產β-丙氨酸的研究.pdf

1、本論文采用PCR擴增基因技術,將工程菌株E. coli BL21 (DE3)/ pET28b(+)-panD的panD基因克隆后連接至pET28c(+)載體上,構建重組質粒pET28c(+)-panD,轉化表達宿主菌E. coli BL21(DE3),經卡納霉素抗性篩選獲得了高效表達L-天冬氨酸α-脫羧酶的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD,酶活力為92.52 U/L。將新構建的菌株與原菌株E.

2、coli BL21 (DE3)/ pET28b(+)-panD進行SDS-PAGE分析比較,發(fā)現(xiàn)新構建的菌株能正確表達PanD,但同樣PanD酶自剪切率低,大部分是未剪切的π’-亞基。以乳糖為誘導劑,對新構建的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化,得到最適培養(yǎng)條件:乳糖誘導時間20 h,乳糖濃度12 g/L,誘導溫度為35℃,誘導菌齡為3.5 h,誘導培養(yǎng)基初始pH 5.5。優(yōu)化后

3、酶活力為186 U/L,與未優(yōu)化前相比,酶活力提高101％。對新構建的工程菌株E. coli BL21(DE3)/ pET28c(+)-panD超聲波破壁后的粗酶液經過硫酸銨分級鹽析和Ni-親和層析兩步純化,PanD酶純度在95％以上,比活力達到了20.15 U/mg,純化倍數(shù)為6.58,回收率為68.34％。通過對純酶進行酶學性質的研究,得到最適反應溫度為45℃,最適pH為8.0,金屬離子對酶活力其幾乎無影響。PanD較穩(wěn)定,高溫可提