鹵代甲烷甲基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究及中華補(bǔ)血草LsNHXs基因的功能研究.pdf

1、第一章鹵代甲烷甲基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)化煙草的研究 甲基溴是在全球被廣泛采用的一種熏蒸殺蟲劑，但是，甲基溴對(duì)臭氧層和環(huán)境有破壞作用。國際組織呼吁盡快淘汰甲基溴，因此，甲基溴替代技術(shù)的開發(fā)迫在眉睫。 鹵代甲烷的生物合成由以下酶促反應(yīng)完成：SAM（S—腺苷甲硫氨酸）+X—（Cl—，Br—，r）→CH3X+S—adenosylhomocysteine（S—腺苷高半胱氨酸），反應(yīng)由一種甲基轉(zhuǎn)移酶（methyl chloride tran

2、sferase MCT）催化完成。本實(shí)驗(yàn)克隆了來源于甜土植物—擬南芥及來源于鹽生植物—鹽芥和鹽地堿蓬的MCT基因AtMCT（AtHOL）、ThMCT和SsMCT。通過基因工程手段將這三個(gè)基因轉(zhuǎn)入煙草，實(shí)現(xiàn)基因的過量表達(dá)。 土壤甲基溴熏蒸的目標(biāo)在于殺死具有較高耐藥性的病源物的孢子或其他休眠形式，熏蒸所需濃度高，這也是造成環(huán)境污染的原因。通過轉(zhuǎn)基因手段，賦予轉(zhuǎn)基因煙草微量、持續(xù)產(chǎn)生甲基溴的能力，病源物侵染時(shí)可直接對(duì)其作用，從而替代甲

3、基溴土壤熏蒸。此技術(shù)在國內(nèi)外尚屬首創(chuàng)。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1）利用RT—PCR和RACE方法克隆獲得ThMCT和SsMCT基因的全長序列。ThMCT基因全長923 bp，開放閱讀框?yàn)?81 bp，共編碼226個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為25.1 KD。SsMCT基因全長1094 bp，開放閱讀框?yàn)?99 bp，共編碼232個(gè)氨基酸，蛋白分子量約為25.8 KD。 2）將AtMCT、 ThMCT和SsMCT的全長OR

4、F構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體pINT4中，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉圓盤法轉(zhuǎn)化煙草，分別獲得了18個(gè)AtMCT．20個(gè)ThMCT和38個(gè)SsMCT基因獨(dú)立的轉(zhuǎn)化株系。 3）對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分子鑒定。PCR分析、Southern和Northern雜交結(jié)果表明外源基因已整合進(jìn)煙草的基因組中并正常轉(zhuǎn)錄。用總蛋白作Western雜交，三種轉(zhuǎn)基因植株均有雜交信號(hào)。但是如果主要用可溶性蛋白作Western雜交，則只有AtMCT轉(zhuǎn)基因植株有雜交信號(hào)，而Th

5、MCT和SsMCT轉(zhuǎn)基因植株均沒有雜交信號(hào)。 4）用不同濃度的處理液處理野生型和轉(zhuǎn)基因煙草，用氣/質(zhì)聯(lián)用儀測定其CH3Cl、CH3Br和CH3I的釋放量。AtMCT轉(zhuǎn)基因植株a12三種氣體的釋放量明顯高于野生型對(duì)照，是對(duì)照的100倍左右，而ThMCT和SsMCT轉(zhuǎn)基因植株的釋放量和對(duì)照差異不明顯。 5）對(duì)AtMCT轉(zhuǎn)基因植株a12和野生型植株接種線蟲，在施加Br—，增加底物的情況下，AtMCT轉(zhuǎn)基因植株提高了對(duì)線蟲的抗性

6、。 第二章中華補(bǔ)血草LsNHXs基因的功能研究 液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與植物耐逆密切相關(guān)，它利用液泡膜H+—ATPase及H+—PPase泵H+產(chǎn)生的驅(qū)動(dòng)力把Na+區(qū)隔化入液泡中以消除Na+的毒害，除此之外，液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還與PH調(diào)節(jié)、囊泡運(yùn)輸、液泡的發(fā)育以及蛋白質(zhì)分選有關(guān)。液泡不僅是一個(gè)物質(zhì)儲(chǔ)存細(xì)胞器，在特定的生理?xiàng)l件下，某些植物細(xì)胞的液泡可參與礦質(zhì)離子、簡單糖類、有機(jī)酸和氨基酸等物質(zhì)的運(yùn)輸。

7、 早期的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)血草鹽腺分泌細(xì)胞內(nèi)有大量的線粒體和豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，缺少清晰的中央大液泡，但細(xì)胞內(nèi)有許多液泡樣的小囊泡，小囊泡大部分都靠近細(xì)胞質(zhì)膜且經(jīng)常出現(xiàn)與質(zhì)膜的融合，推測囊泡運(yùn)輸參與了補(bǔ)血草的泌鹽過程。由此推測補(bǔ)血草液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LsNHXs將對(duì)補(bǔ)血草的泌鹽產(chǎn)生一定的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)克隆了LsNHXs基因，并利用RNAi技術(shù)對(duì)其功能進(jìn)行了研究。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1）采用RT—PCR和3

8、’—RACE方法從補(bǔ)血草中克隆獲得LsNHXs基因家族三個(gè)成員LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的保守區(qū)序列以及LsNHX2和LsNHX3的3’端特異序列。 2）構(gòu)建植物基因RNAi沉默表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化補(bǔ)血草，獲得三個(gè)單基因和一個(gè)雙基因的RNAi沉默表達(dá)植株，快繁轉(zhuǎn)基因植株供分子鑒定和耐逆分析。 3） LsNHX1轉(zhuǎn)基因植株葉片表面分泌物中的Na+、K+離子含量比野生型對(duì)照顯著增加；葉組織內(nèi)Na+離子含量和K+離子含

9、量均略高，但差異不顯著；K+/Na+比沒有顯著差異。 4） LsNHK2轉(zhuǎn)基因植株葉片表面分泌物中的Na+離子含量比野生型對(duì)照有所下降，但差異不顯著；K+離子含量比對(duì)照顯著降低。LsNHX2轉(zhuǎn)基因植株葉組織內(nèi)Na+離子含量略高，但差異不顯著；K+離子含量和K+/Na+比均降低。 5） LsNHX3轉(zhuǎn)基因植株葉片表面分泌物中的Na+離子含量比對(duì)照增加，但差異不顯著，K+離子含量比對(duì)照增加，在400 mM NaCl條件下達(dá)到

10、顯著差異；葉組織內(nèi)Na+離子含量和K+離子含量均略高；K+/Na+比沒有顯著差異。 6）LsNHX1+LsNHX2雙基因沉默植株葉片表面分泌物中的Na+離子含量比野生型對(duì)照增加，K+離子含量與野生型對(duì)照相比沒有顯著差異。轉(zhuǎn)基因植株葉中Na+離子含量略高，但差異不顯著；轉(zhuǎn)基因植株葉中K+離子含量及K+/Na+比均降低。 以上結(jié)果表明，LsNHX1、LsNHX2和LsNHX3的作用機(jī)制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上，沉

11、默表達(dá)后，區(qū)隔化的Na+離子含量降低，導(dǎo)致通過囊泡運(yùn)輸分泌的Na+離子含量降低。LsNHX1和LsNHX3可能定位于中央大液泡上，主要負(fù)責(zé)Na+的區(qū)隔化；沉默表達(dá)后，液泡中區(qū)隔化的Na+離子含量降低，胞質(zhì)中的Na+離子含量增加，刺激鹽腺泌鹽，導(dǎo)致葉片分泌的Na+離子含量增加。 本研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1.首次克隆了鹽生植物—鹽芥、鹽地堿蓬的鹵代甲烷甲基轉(zhuǎn)移酶基因ThMCT和SsMCT，并對(duì)其序列特征進(jìn)行了詳細(xì)的分析。

12、 2.通過過量表達(dá)鹵代甲烷甲基轉(zhuǎn)移酶基因，提高轉(zhuǎn)基因煙草釋放甲基溴的能力，使轉(zhuǎn)基因煙草微量、持續(xù)產(chǎn)生甲基溴，從而替代甲基溴土壤熏蒸。此技術(shù)在國內(nèi)外尚屬首創(chuàng)。 3.首次克隆了補(bǔ)血草的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LsNHXs基因家族三個(gè)成員LsNHK1、LsNHX2和LsNHX3的部分序列，并將這三個(gè)基因分別作了RNAi沉默表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)LsNHX1、LsNHX2、LsNHX3的作用機(jī)制不同。LsNHX2可能定位于小囊泡上，通過