大豆疫霉無毒基因PsAvr5和PsAvrlc的克隆及PsAvr3c的多態(tài)性研究.pdf

1、大豆是世界范圍的一種重要的糧食、工業(yè)和能源作物。由大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）引起的大豆莖腐和根腐病是最具有破壞性的大豆病害之一。根據(jù)“基因?qū)颉睂W(xué)說，大豆-大豆疫霉菌這一病理體系中的抗病基因和相應(yīng)的無毒基因符合基因與基因互作。目前，利用抗病基因培育抗病品種是防治大豆疫病的主要途徑。因此，在分子水平上闡述大豆疫霉無毒基因和大豆抗病基因的互作機(jī)理有助于理解病害發(fā)生的機(jī)制，從而為大豆的育種及大豆疫病的控制提供理論依據(jù)

2、。本研究結(jié)合遺傳作圖、大豆疫霉全基因組預(yù)測的RXLR效應(yīng)蛋白數(shù)據(jù)和大豆疫霉菌株的單體型分析推斷PsAvr5和PsAvr3a是等位基因，并運(yùn)用植物基因槍瞬時表達(dá)技術(shù)和大豆疫霉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)證實(shí)PsAvr5和PsAvr3a是等位基因，從而克隆出大豆疫霉無毒基因PsAvr5;大豆疫霉菌株ACR10和P7076雜交后代的毒性特征的遺傳分析表明大豆疫霉無毒基因PsAvr1c是一個單顯性基因，對其候選基因進(jìn)行了檢測，并運(yùn)用分離群體分組分析法篩選到

3、3個與其相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，推斷該基因定位于基因組中3個位點(diǎn)所在的一段94 Kb的區(qū)域內(nèi)，從而為該無毒基因的克隆奠定了基礎(chǔ);初步研究了中國大豆疫霉群體中無毒基因Avr3c的多態(tài)性，為揭示大豆疫霉菌的毒性變異機(jī)制提供了分子理論依據(jù)。
　　 大豆疫霉是一種植物病原卵菌，它可以引起大豆的根腐和莖腐病。大豆疫霉無毒基因（Avr）的編碼產(chǎn)物被大豆抗病基因（Rps）的編碼產(chǎn)物識別后會激發(fā)大豆產(chǎn)生抗病反應(yīng)。以前的研究表明PsAvr5和P

4、sAvr3a遺傳連鎖。遺傳作圖、大豆疫霉全基因組預(yù)測的RXLR效應(yīng)蛋白數(shù)據(jù)和大豆疫霉菌株的單體型分析推斷PsAvr5和PsAvr3a是等位基因。運(yùn)用植物基因槍瞬時表達(dá)試驗和大豆疫霉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化試驗進(jìn)行功能驗證。植物基因槍瞬時表達(dá)試驗顯示PsAvr3a P6497可以在含有Rps5的大豆鑒別寄主上引起特異的細(xì)胞壞死，而PsAvr3aACR12和PsAvr3aP7064卻不能。這證明了PsAvr5和PsAvr3a是等位基因，PsAvr3aP

5、649是PsAvr5的無毒等位基因而PsAvr3aACR12和PsAvr3aP7064卻不是。利用大豆疫霉穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化體系，在毒性菌株P(guān)7074中過量表達(dá)外源的PsAvr3aP6497基因從而得到在含有Rps3a和Rps5的大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無毒性狀的轉(zhuǎn)化子菌株，以及在無毒菌株P(guān)6497中沉默PsAvr3aP6497基因從而得到在含有Rps3a和Rps5的大豆鑒別寄主上不再表現(xiàn)為無毒性狀的轉(zhuǎn)化子菌株，從而進(jìn)一步證明PsAvr3aP64

6、97可以與Rps5互作，即是PsAvr5的無毒等位基因。序列分析發(fā)現(xiàn)2個關(guān)鍵氨基酸的差異決定是否受到Rps3a或Rps5的識別。
　　 為了克隆大豆疫霉無毒基因PsAvr1c，構(gòu)建了大豆疫霉菌株ACR10和P7076的雜交群體。ACR10在Rps1c大豆鑒別寄主(L75-3735)上表現(xiàn)為無毒而P7076表現(xiàn)為毒性。在25個雜合的F1后代中，12個F1后代在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無毒，一個F1后代在Rps1c大豆鑒別寄主

7、上表現(xiàn)為毒性，而其余12個F1后代失去了基本致病性或者重復(fù)測定的毒力表型不一致。一個在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無毒的F1后代(F1-62)自交產(chǎn)生了40個F2后代。其中22個F2后代在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無毒，6個F2后代在Rps1c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為毒性，其余的失去了基本致病性或者重復(fù)測定的毒力表型不一致?？ǚ椒治鲲@示F2后代在Rps1c大豆鑒別寄主上的毒力性狀的分離比例符合無毒∶毒性為3∶1的假設(shè)(P＞0.05)。

8、因此，推斷控制大豆疫霉親本菌株對Rps1c大豆鑒別寄主的無毒性狀的PsAvr1c基因是一個單顯性基因。通過比較基因組學(xué)分析了4個菌株R2(P6497)、R7(P7064)、R17(P7074)和R19(P7076)的全基因組序列，篩選到75個具有序列多態(tài)性特征，且這種序列多態(tài)性特征與4個菌株在Rps1c大豆鑒別寄主上的毒力表型是一致的編碼RXLR motif的基因。將這些基因作為PsAvr1c的候選基因。CAPs鑒定發(fā)現(xiàn)其中20個Avh

9、基因不是PsAvr1c，并且這20個CAPs標(biāo)記也不與PsAvr1c位點(diǎn)連鎖。檢測了46個大豆疫霉Avh基因在親本菌株ACR10和P7076中的轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)PsAvh111具有轉(zhuǎn)錄多態(tài)性的特征，在無毒菌株ACR10中可以表達(dá)而在毒性菌株P(guān)7076中卻不表達(dá)。但其在檢測的無毒和毒性F2后代中卻不存在明顯的轉(zhuǎn)錄多態(tài)性特征，因此PsAvh111也不是PsAvr1c。采用分離群體分組分析法構(gòu)建了一個無毒池和一個毒性池。通過全基因組測序篩選到3

10、個與PsAvr1c位點(diǎn)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，推斷該基因定位于基因組中3個位點(diǎn)所在的一段94 Kb的區(qū)域內(nèi)，從而為該無毒基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　 選擇22個不同地理來源的中國大豆疫霉菌株，并提取其基因組DNA。設(shè)計特異性引物并擴(kuò)增出大豆疫霉無毒基因Avr3c的全長及其部分兩端序列，測序結(jié)果表明Avr3c存在3種核苷酸序列多態(tài)性，分別為Avr3c-1、 Avr3c-2和Avr3c-3。在Rps3c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為無毒的菌

11、株中Avr3c核苷酸序列為類型Avr3c-1。在Rps3c大豆鑒別寄主上表現(xiàn)為毒性的菌株:15個毒性菌株的Avr3c核苷酸序列也為類型Avr3c-1;5個毒性菌株的Avr3c核苷酸序列為類型Avr3c-2，它與無毒菌株中的類型Avr3c-1的核苷酸序列相似性為97％;1個毒性菌株的Avr3c核苷酸序列為類型Avr3c-3，它與無毒菌株中的類型Avr3c-1的核苷酸序列相似性為96％。氨基酸序列分析顯示相對于無毒菌株中的類型Avr3c-1

12、，毒性菌株中的類型Avr3c-1的序列和其一樣、類型Avr3c-2的14個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變、類型Avr3c-3的21個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變且一個氨基酸位點(diǎn)發(fā)生缺失。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)Avr3c在含有類型Avr3c-1的2個毒性菌株中不轉(zhuǎn)錄。全長序列的非同義突變與同義突變的比值(dN/dS)大于1揭示Avr3c受到了來自寄主植物抗病基因強(qiáng)大的正向選擇壓力。單氨基酸位點(diǎn)的正向選擇壓力分析鑒定出Avr3c存在21個發(fā)生正向選擇的氨基酸位點(diǎn)(