尼羅羅非魚MHC基因的克隆、表達及多態(tài)性研究.pdf

1、主要組織相容性復合體(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)是脊椎動物中編碼免疫球蛋白樣受體的基因家族，常呈現出高度的遺傳多樣性，與動物的抗病性和生長發(fā)育等重要經濟性狀密切相關。本研究以我國重要的養(yǎng)殖魚類尼羅羅非魚為實驗材料，采用PCR、同源克隆、RACE、RT-PCR等技術，對MHC家族ⅠA、ⅡA和ⅡB3個基因進行了克隆、表達與多態(tài)性分析。主要研究結果如下：
　　 (1)獲得尼羅羅非魚MHCⅠA

2、基因cDNA的3’端序列，MHCⅡA、MHCⅡB基因的cDNA全序列：獲得的MHCⅠA基因cDNA3’端序列長957bp，含666bp的CDS和291bp的3'-UTR區(qū)，其中3'-UTR區(qū)具有真核生物共有的加尾信號AATAAA和29bp的PolyA尾巴，其編碼的221個氨基酸包含了部分的多肽結合區(qū)、全部的IGC區(qū)以及跨膜區(qū)和胞質區(qū)：MHCⅡA基因cDNA序列全長1205bp(Orni-DBA*0101，Genebank登錄號：JF71

3、9813)，開放閱讀框長720bp，編碼的蛋白質分子包含1個信號肽、2個胞外結構域(α-1和α-2)、1個跨膜區(qū)和1個胞質區(qū)，存在4個保守的半胱氨酸殘基以及豐富的磷酸化位點，與其他物種的相似性在23％-65％之間；MHCⅡB基因cDNA序列全長1143bp(Orni-DAB*0101，Genebank登錄號：JF713026)，包含35bp的5'-UTR、756bp的開放閱讀框和352bp的3'-UTR，編碼的蛋白質分子包含1個信號肽、

4、2個胞外結構域(β-1和β-2)、1個跨膜區(qū)和1個胞質區(qū)，存在豐富的磷酸化位點，與其他物種的相似性在27％到70％之間。
　　 (2)獲得了MHCⅡA及MHCⅡB基因組DNA序列：MHCⅡA基因組序列長1388bp，含4個外顯子和3個內含子，外顯子1編碼信號肽區(qū)，外顯子2編碼α-1區(qū)，外顯子3編碼α-2區(qū)，外顯子4編碼跨膜區(qū)及胞質區(qū)；MHCⅡB基因組序列長2428bp，含6個外顯子和5個內含子，外顯子1編碼信號肽區(qū)，外顯子2編碼

5、β-1結構域，外顯子3和4共同編碼β-2結構域，外顯子5和6編碼連接肽、跨膜區(qū)以及胞質區(qū)。
　　 (3)MHCⅡA及MHCⅡB分子均由多個基因位點編碼，等位基因間均存在豐富的多態(tài)性，且變異主要集中在多肽結合區(qū)：從4尾健康的尼羅羅非魚肝臟cDNA中共得到8個MHCⅡA序列，8條序列間存在豐富的多態(tài)性且主要集中在α-1區(qū)，其中從1個個體獲得4條不同的cDNA序列，這預示著尼羅羅非魚MHCⅡA基因至少存在2個基因座位；從5尾尼羅羅非魚

6、中獲得10個MHCⅡB序列且等位基因序列間存在豐富的變異，變異主要集中在β-1區(qū)，其中從同一個體獲得5條不同的cDNA序列，預示著尼羅羅非魚MHCⅡB中至少有3個基因座位。
　　 (4)RT-PCR分析結果顯示，遞呈外源性抗原的MHCⅡA及MHCⅡB基因在健康尼羅羅非魚的腦、心、脾、肝、頭腎、腸、肌肉、鰭、胸腺、性腺、鰓和胃12個組織中均有表達，但是表達量有所差異，體現了其表達與功能的適應性：MHCⅡA基因在脾、腎、腸、鰓、性腺

7、、肝、心臟組織中表達量很高，在鰾和肌肉中表達量最低；MHCⅡB基因在脾、腎、鰓和腸中表達量最高，性腺、肝、心臟、腦、鰭、胃中表達程度中等，在鰾和肌肉組織中表達量最低。
　　 (5)人工感染嗜水氣單胞菌，應用RT-PCR半定量技術，檢測了感染后不同時期尼羅羅非魚5個組織(肝、脾、腎、鰓、腸)中MHCⅡA及MHCⅡB基因mRNA表達水平的變化。結果顯示，5個組織中MHCⅡA及MHCⅡB基因的mRNA水平均發(fā)生了不同程度的變化，提示M