尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）催乳素（PRL）及其受體（PRLR）的cDNA克隆及表達(dá)分析.pdf

1、本論文以尼羅羅非魚這一經(jīng)濟(jì)魚類為研究對象，克隆了兩種PRL和PRL受體的cDNA，并檢測它們的基因表達(dá)在魚體中的時(shí)間和空間分布，著重了解兩種不同的PRLR在羅非魚中的調(diào)控作用，對這一經(jīng)濟(jì)魚類生長和繁殖的內(nèi)分泌學(xué)進(jìn)行研究，從而有助于掌握其生長繁殖方面的特點(diǎn)，更好地為生產(chǎn)服務(wù)。 采用RT-PCR方法分別克隆了尼羅羅非魚PRL1，PRL2，PRLR1以及PRLR2基因的cDNA序列。PRL1的開放閱讀框?yàn)?39bp,共編碼212個(gè)氨基

2、酸；PRL2的開放閱讀框?yàn)?03bp,共編碼200個(gè)氨基酸；PRLR1的開放閱讀框?yàn)?893bp,共編碼630個(gè)氨基酸；PRLR2的開放閱讀框?yàn)?590bp,共編碼529個(gè)氨基酸。根據(jù)GenBank中其它魚類相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行相似性比較并構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果與根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化特征分類進(jìn)化地位基本一致。 PRLR2cDNA全長2011個(gè)堿基，包括5'端非翻譯區(qū)(UTR)217個(gè)堿基和3'UTR204個(gè)堿基，經(jīng)SMA

3、RT分析，該cDNA編碼的的多肽鏈序列具有以下特點(diǎn)：前27個(gè)氨基酸為信號肽；序列內(nèi)部23個(gè)親水氨基酸為跨膜區(qū)；細(xì)胞外區(qū)由206個(gè)氨基酸組成，四個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)分別位于成熟肽的85、106、154、和192位氨基酸處；細(xì)胞內(nèi)區(qū)由273個(gè)氨基酸組成，8個(gè)可被酪氨酸激酶磷酸化的酪氨酸殘基分別位于第237、286、296、382、396、432、462和第492位氨基酸上。用DNAstar對尼羅羅非魚魚和其它13種脊椎動物的PRLR前體蛋

4、白和成熟蛋白的細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)它與金頭鯛的同源性最高；對脊椎動物各種形式的PRLR前體進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)該受體與金頭鯛的親緣關(guān)系最近。通過與尼羅羅非魚PRLR1進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)PRLR2和并非PRLR1來自同一個(gè)前體的不同剪接形式，而是由不同基因編碼的。同時(shí)我們在卵巢中克隆得到一個(gè)只有細(xì)胞內(nèi)區(qū)的短型的PRLR2，共編碼83個(gè)氨基酸。 根據(jù)己獲得PRLR1、PRLR2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)各自的特異

5、引物，比較各組織(垂體、下丘腦、端腦、中腦、后腦、鰓、心臟、頭腎、肝臟、脾臟、腎臟、性腺、胃、腸、肌肉)基因表達(dá)量的差異，發(fā)現(xiàn)PRLR1、PRLR2在鰓，腎臟、腸、性腺均有較大量表達(dá)。Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)在尼羅羅非魚的卵巢中存在兩種不同的PRLR2轉(zhuǎn)錄本，這與我們克隆得到了兩種PRLR2相一致。 由于催乳素在動物的性腺發(fā)育及繁殖中具有重要的作用，為了探討兩種不同催乳素受體在性腺發(fā)育過程中的表達(dá)差異，通過實(shí)時(shí)PCR方法，比

6、較了不同性腺發(fā)育階段尼羅羅非魚性腺催乳素受體的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)無論雌魚還是雄魚，兩種受體的mRNA的表達(dá)量均為成熟期最高，而且PRLR2在各時(shí)期的表達(dá)量均高于PRLR1。檢測了注射LHRH-A之后，尼羅羅非魚卵巢中兩種受體mRNA表達(dá)量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論雌魚還是雄魚，注射LHRH-A12小時(shí)后PRLRmRNA表達(dá)量達(dá)到高峰，之后有所下降，其中雌魚的PRLR2變化最為明顯，與對照組相比有了顯著的增加。注射E2和MT對雌魚的PRLR作用不明