水貂IGF-1R基因克隆、表達(dá)及多態(tài)性分析.pdf

1、水貂（ Neovison vison）作為一種小型珍貴毛皮動(dòng)物，屬于哺乳綱，食肉目，鼬科，鼬屬。水貂主要經(jīng)濟(jì)價(jià)值體現(xiàn)在貂皮，而水貂的生長性狀情況直接影響貂皮的質(zhì)量。本研究以銀藍(lán)水貂和美國短毛黑水貂為研究對(duì)象，在 DNA、RNA和蛋白質(zhì)三個(gè)水平上研究 IGF-1R基因與水貂生長發(fā)育的相關(guān)性，為深入研究與水貂生長性狀相關(guān)的分子遺傳標(biāo)記提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為水貂的選育奠定理論基礎(chǔ)。
　　水貂IGF-1R基因的克隆、真核表達(dá)及鑒定。提取水貂肝臟

2、總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，根據(jù)GenBank報(bào)道的2個(gè)物種（雪貂、人）中IGF-1R序列為參考，設(shè)計(jì)水貂特異性IGF-1R引物，PCR擴(kuò)增得到CDS序列，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收并與pEASY-Blunt Zero克隆載體連接并轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell中，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證該序列為目的序列，從陽性重組質(zhì)粒擴(kuò)增目的片段連接到pEASY-Blunt M3載體

3、上，經(jīng)驗(yàn)證重組pEASY-Blunt M3-IGF-1R質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到293 T細(xì)胞中，提取總蛋白，并用Western Blot技術(shù)檢測(cè)水貂IGF-1R蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明：（1）以水貂肝臟為樣品，利用RT-PCR成功擴(kuò)增出全部的水貂IGF-1R基因CDS序列，長度為4104 bp，編碼1367個(gè)氨基酸；（2）獲得的水貂IGF-1R基因與雪貂、人同源基因相似性分別為99％和91%。認(rèn)為該序列為水貂 IGF-1R基因 CDS序列；

4、（3）成功構(gòu)建pEASY-Blunt M3-IGF-1R真核表達(dá)載體，經(jīng)驗(yàn)證成功獲得水貂IGF-1R蛋白。本研究為從受體角度闡明水貂IGF-1R如何調(diào)控生長發(fā)育，為下一步功能研究奠定基礎(chǔ)。
　　水貂IGF-1R基因的SNPs篩查及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析。選用同場(chǎng)打皮時(shí)銀藍(lán)水貂（♂，69只）和美國短毛黑水貂（♂，75只），測(cè)量體重體長，并采集血液樣本。利用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行部分外顯子SNPs篩查，采用POPGene32軟件開

5、展SNPs位點(diǎn)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，通過SPSS（19.0）軟件GLM統(tǒng)計(jì)模型進(jìn)行SNPs不同基因型與水貂生長性狀的相關(guān)性分析。結(jié)果表明：在IGF-1R基因外顯子序列中檢測(cè)到2個(gè)同義突變位點(diǎn)：c.207G>A和c.1782G>A。群體遺傳學(xué)分析顯示，在銀藍(lán)水貂群體中，c.207G>A位點(diǎn)為低度多態(tài)，c.1782G>A屬中度多態(tài)，而這2個(gè)位點(diǎn)在美國短毛黑水貂群體中均為中度多態(tài)。χ2檢查表明，c.207G>A和c.1782G>A兩個(gè)位點(diǎn)在銀藍(lán)水