大豆疫霉G蛋白和鈣信號(hào)途徑的功能分析.pdf

1、大豆疫霉(Phytophthora sojae)侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生產(chǎn)上的主要病害之一.大豆疫霉在田間的傳播主要通過形成孢子囊，釋放游動(dòng)孢子，在水膜存在的條件下，通過識(shí)別植株分泌的異黃酮等化學(xué)信號(hào)分子，定向游動(dòng)，尋找寄主植物，最終成功侵染感病植物.所以了解大豆疫霉菌無性發(fā)育過程中孢子囊和游動(dòng)孢子的形成和游動(dòng)孢子的趨化性機(jī)制，可以為尋找新的殺菌劑作用靶標(biāo)，防止病害的發(fā)生和擴(kuò)展提供理論依據(jù). 大豆疫霉G蛋白效應(yīng)因子和鈣離

2、子結(jié)合蛋白預(yù)測(cè)與分析.大豆疫霉孢子囊的形成和游動(dòng)孢子的行為受到各種外界條件影響和胞內(nèi)信號(hào)傳遞的控制.卵菌中陸續(xù)報(bào)道了G蛋白和鈣信號(hào)途徑的基因在孢子囊形成和游動(dòng)孢子行為方面的作用，為大豆疫霉孢子囊的形成和游動(dòng)孢子趨化性機(jī)制的研究提供了有利的借鑒作用.本文對(duì)大豆疫霉的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了搜索，尋找到包括腺苷酸環(huán)化酶、G蛋白信號(hào)調(diào)解因子和磷脂酶D在內(nèi)的G蛋白效應(yīng)因子以及包括鈣調(diào)素和鈣離子調(diào)控的蛋白激酶在內(nèi)的鈣離子結(jié)合蛋白，并分析了其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和基

3、因組分布.發(fā)現(xiàn)了以腺苷酸環(huán)化酶為代表的G蛋白效應(yīng)分子的特征.候選基因的EST分析結(jié)果表明，G蛋白和鈣信號(hào)途徑在大豆疫霉的侵染過程中可能起著更加重要的作用. 大豆疫霉G蛋白和鈣信號(hào)途徑的轉(zhuǎn)錄分析.為了研究G蛋白和鈣信號(hào)途徑在大豆疫霉發(fā)育和致病過程中的作用，并對(duì)前一章所進(jìn)行的推測(cè)進(jìn)行驗(yàn)證，本文挑選了20個(gè)可能與G蛋白和鈣信號(hào)途徑相關(guān)的基因，利用半定量RT-PCR對(duì)候選基因進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)脅迫、氧化壓力、孢子囊產(chǎn)生和游動(dòng)孢子等不同生長(zhǎng)階段以

4、及侵染早期的轉(zhuǎn)錄分析，以揭示G蛋白和鈣信號(hào)途徑的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果表明，包括G蛋白a和B亞基雀內(nèi)的10個(gè)基因在大豆疫霉孢子囊形成階段的轉(zhuǎn)錄水平較營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段明顯升高；13個(gè)基因在游動(dòng)孢子中的轉(zhuǎn)錄水平較營(yíng)養(yǎng)菌絲和孢子囊中有明顯降低，其中10個(gè)基因編碼的蛋白參與鈣信號(hào)途徑；在大豆疫霉侵染大豆早期，編碼G蛋白a和B亞基的基因PsGPA1和PsGPB1表現(xiàn)出明顯的上調(diào)表達(dá).G蛋白a亞基是所有候選基因中唯一既在游動(dòng)孢子中誘導(dǎo)表達(dá)，叉在侵染階段誘導(dǎo)表達(dá)

5、的基因。深入分析PsGPA1和PsGPB1在大豆疫霉無性發(fā)育階段的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，在大豆疫霉的游動(dòng)孢子游動(dòng)階段，G蛋白a亞基有可能抑制了胞內(nèi)鈣信號(hào)的激活。 G蛋白a亞基對(duì)于大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的作用研究。大豆疫霉的游動(dòng)孢子對(duì)異黃酮類物質(zhì)的趨化性是其識(shí)別和侵染寄主的前提，然而，這種趨化性的分子機(jī)制目前尚不清楚.G蛋白a亞基既能夠在大豆疫霉的游動(dòng)孢子中誘導(dǎo)表達(dá)，又能夠在侵染早期誘導(dǎo)表達(dá).為了研究其是否與游動(dòng)孢子對(duì)異黃酮物質(zhì)的趨化性

6、機(jī)制相關(guān)，本研究利用基因沉默技術(shù)，獲得了G蛋白a亞基的基因沉默突變體。突變體的表型分析結(jié)果表明，Ga的沉默不會(huì)影響菌絲的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和孢子囊的產(chǎn)生，但卻嚴(yán)重影響了游動(dòng)孢子對(duì)不同濃度異黃酮類物質(zhì)的趨化性.游動(dòng)孢子趨化性的喪失和休止速度的加快降低了突變體在大豆根部的附著能力；休止胞萌發(fā)能力也隨之改變，導(dǎo)致突變體游動(dòng)孢子即使與大豆根部接觸也很難成功侵染。此外，Ga沉默突變體游動(dòng)孢子中鈣調(diào)素基因表達(dá)量明顯升高，說明Ga亞基有可能是鈣信號(hào)途徑的負(fù)調(diào)控

7、因子. Ga結(jié)合蛋白的篩選與受Ga調(diào)控的信號(hào)途徑分析.大豆疫霉的G蛋白a亞基不僅影響著孢子囊的割裂和游動(dòng)孢子的釋放，而且控制著游動(dòng)孢子的游動(dòng)能力和休止胞的萌發(fā)能力。Ga亞基是通過調(diào)節(jié)哪些基因的表達(dá)、影響哪些信號(hào)通路、怎樣傳遞信號(hào)來控制這些性狀，尚未研究清楚.本文構(gòu)建了大豆疫霉的cDNA文庫(kù)，并以大豆疫霉Ga亞基為誘餌蛋白，利用酵母雙雜交的方法，篩選到包括磷酸核酮糖差向異構(gòu)酶和逆轉(zhuǎn)錄酶等7個(gè)可能與Ga相互作用的蛋白，說明G蛋白信

8、號(hào)途徑參與了大豆疫霉的糖代謝。同時(shí)，本文通過cDNA Macroarray的方法，比較分析了大豆疫霉野生型和Ga突變體游動(dòng)孢子中的基因表達(dá)變化，得到了9個(gè)在Ga突變體游動(dòng)孢子中轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化的基因。這9個(gè)基因中有3個(gè)G蛋白信號(hào)調(diào)控因子(RGS)、一個(gè)Ca2+AIP酶和一個(gè)依賴于Ca2+/鈣調(diào)素的蛋白激酶的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生下降；鈣調(diào)素、兩個(gè)Ca2+/鈣調(diào)素的蛋白激酶和一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子類似物的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高.這說明RGS和Ga在信號(hào)傳遞過程中可