辣椒疫霉效應(yīng)分子編碼基因的克隆及功能分析.pdf

1、辣椒疫霉是一種寄主范圍廣的半活體營(yíng)養(yǎng)型植物病原卵菌，常危害茄科、葫蘆科和豆類等蔬菜的安全生產(chǎn)。由于疫霉菌在進(jìn)化上與真菌相差甚遠(yuǎn)，現(xiàn)有的殺菌劑大多對(duì)植物疫病防治無(wú)效，加之品種抗病性利用尚不理想，一直以來(lái)還沒(méi)有有效的辣椒疫霉防控手段。因此，在傳統(tǒng)的防治措施之外，從疫霉菌與植物互作的角度出發(fā)深入了解疫霉菌致病的分子機(jī)理，對(duì)開(kāi)發(fā)新的殺菌劑作用靶標(biāo)、設(shè)計(jì)植物疫病控制策略具有重要價(jià)值。
　　本論文首先研究了辣椒疫霉在侵染前期差異表達(dá)的基因種類

2、。通過(guò)對(duì)侵染前期三個(gè)關(guān)鍵階段（菌絲、游動(dòng)孢子和萌發(fā)休止孢）的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析，篩選出98個(gè)在這些階段差異表達(dá)的效應(yīng)分子編碼基因，其中包含25個(gè)RXLR、9個(gè)CRN和16個(gè)Elicitin編碼基因。
　　利用半定量RT-PCR技術(shù)，分析獲得的效應(yīng)分子編碼基因在辣椒疫霉侵染階段（本氏煙接種后1.5、3、6、12、24、36、72 h）和侵染前期階段（菌絲、游動(dòng)孢子囊、游動(dòng)孢子和萌發(fā)休止孢）的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)35個(gè)基因在辣椒

3、疫霉侵染本氏煙的過(guò)程中差異表達(dá)，包括RXLR(12個(gè))、CRN（5個(gè)）、Elicitin(13個(gè))、PcF/SCR（2個(gè)）和NLP（3個(gè)）基因。不同類型效應(yīng)分子在侵染過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄模式不同，同一類型的不同效應(yīng)分子的轉(zhuǎn)錄模式也存在差異。
　　通過(guò)高保真擴(kuò)增技術(shù)將這35個(gè)侵染階段差異表達(dá)的效應(yīng)基因克隆到馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)表達(dá)載體中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)法分析這些基因是否能夠引起本氏煙植物的細(xì)胞死亡(

4、Plant cell death, PCD)。結(jié)果表明，4個(gè)Elicitin、1個(gè)NLP以及1個(gè)RXLR效應(yīng)分子均能誘導(dǎo)本氏煙的PCD。為進(jìn)一步明確效應(yīng)分子引起PCD的功能區(qū)域，對(duì)其中的RXLR效應(yīng)分子Pc129113進(jìn)行了缺失和替換突變分析，構(gòu)建了13個(gè)突變體。結(jié)果顯示，第1和第2個(gè)W-Y-L domain對(duì)其觸發(fā)本氏煙PCD的功能是必需的，第81～312位氨基酸殘基對(duì)其維持觸發(fā)PCD的功能很重要。
　　除上述6個(gè)基因之外，其余

5、的基因不能誘導(dǎo)本氏煙產(chǎn)生PCD。本研究分析了RXLR和CRN效應(yīng)分子對(duì)本氏煙PCD的抑制情況，分析其是否具有毒性因子的作用。所選取的觸發(fā)本氏煙PCD的效應(yīng)分子包括INF1、BAX、PsCRN63、PsojNIP、PsAvh241、R3a/AVR3a。結(jié)果表明，大多數(shù)效應(yīng)分子(15/17)具有抑制寄主植物PCD的毒性功能。其中，效應(yīng)分子中64.7％能夠抑制INF1所誘導(dǎo)的PCD，82.4％能夠抑制BAX誘導(dǎo)的PCD，76.5％能夠抑制Ps

6、CRN63誘導(dǎo)的PCD，88.2％能夠抑制PsAvh241和PsojNIP所誘導(dǎo)的PCD，而只有17.6％能夠抑制AVR3a/R3a組合所誘導(dǎo)的PCD。預(yù)測(cè)含有典型的核定位信號(hào)(NLS)的RXLR效應(yīng)分子Pc503142能夠抑制本氏煙產(chǎn)生的PCD。為明確該效應(yīng)分子的功能區(qū)域，對(duì)其進(jìn)行了缺失和替換突變分析，構(gòu)建了4個(gè)突變體。結(jié)果顯示其NLS的缺失導(dǎo)致其抑制PCD毒力功能的喪失，表明該效應(yīng)分子可能是在寄主細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。為進(jìn)一步明晰辣椒疫

7、霉效應(yīng)分子是否具有毒性功能，本研究利用辣椒疫霉菌株接種已經(jīng)表達(dá)效應(yīng)分子的本氏煙葉片，測(cè)量在其表達(dá)的情況下，病原菌的侵染是否更加劇烈。結(jié)果表明，兩個(gè)CRN效應(yīng)分子(Pc559084和Pc563418)在本氏煙上的表達(dá)能夠顯著促進(jìn)辣椒疫霉侵染本氏煙。
　　為明確效應(yīng)分子在進(jìn)化過(guò)程中面臨的寄主選擇壓力，分析了來(lái)自全國(guó)不同地區(qū)的36個(gè)辣椒疫霉菌株中RXLR和PcF/SCR效應(yīng)分子的序列多態(tài)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三個(gè)RXLR效應(yīng)分子(Pc10734

8、9、Pc503142和Pc129113)均有豐富的序列多態(tài)性，PcF/SCR效應(yīng)分子Pc96045家族至少含有4個(gè)成員。結(jié)果說(shuō)明，這些效應(yīng)分子可能在侵染寄主植物的過(guò)程中起著重要的作用，在進(jìn)化的過(guò)程中面臨著很大的寄主選擇壓力。
　　為進(jìn)一步分析上述效應(yīng)分子的功能，在辣椒疫霉中進(jìn)行基因沉默分析，測(cè)定轉(zhuǎn)化子的致病力和生物學(xué)性狀是否產(chǎn)生變化。對(duì)3個(gè)RXLR效應(yīng)分子(Pc107349、Pc503142和Pc129113)進(jìn)行基因沉默，結(jié)果發(fā)

9、現(xiàn)這三個(gè)基因的沉默均導(dǎo)致辣椒疫霉對(duì)本氏煙的致病力降低。而且，基因Pc503142的沉默轉(zhuǎn)化子對(duì)外源活性氧的耐受性降低，表明Pc503142可能在抑制本氏煙抗病相關(guān)的活性氧途徑中發(fā)揮作用。類似地，基因沉默實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PcF/SCR效應(yīng)分子Pc96045對(duì)辣椒疫霉的致病性具有重要作用。綜上所述，基因沉默結(jié)果表明，RXLR和PcF/SCR效應(yīng)分子在辣椒疫霉侵染寄主植物的過(guò)程中起著重要的作用。
　　本論文通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及RT-PCR分析，獲得

10、了35個(gè)在生長(zhǎng)發(fā)育和侵染階段差異表達(dá)的辣椒疫霉效應(yīng)分子;利用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)法在本氏煙上瞬時(shí)表達(dá)這些效應(yīng)分子，明確了效應(yīng)分子抑制植物免疫反應(yīng)的毒性功能，或者觸發(fā)植物免疫反應(yīng)的無(wú)毒性功能;進(jìn)一步利用CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)和dsRNA介導(dǎo)的基因瞬時(shí)沉默技術(shù)分析效應(yīng)分子的功能，明確了4個(gè)效應(yīng)分子(Pc107349、Pc503142、Pc129113和Pc96045)對(duì)辣椒疫霉的致病性具有重要作用。本論文通過(guò)差異表達(dá)基因篩選、克隆和