辣椒疫霉elicitin基因及白菜BpERF1基因的功能分析.pdf

1、辣椒(Capsicum annuum L.)和大白菜(Brassica campestris ssp.pekinensis)是在我國廣泛種植的重要蔬菜,病害及其它各種非生物逆境始終困擾著這些蔬菜生產(chǎn),影響其產(chǎn)量、品質(zhì)和效益。培育和推廣應(yīng)用抗逆性強的品種或者采取更為有效的管理措施以解決上述問題已經(jīng)越來越迫切,作為上述技術(shù)策略的重要基礎(chǔ),開展蔬菜的抗逆分子機制研究,鑒定其基因組中具有重要應(yīng)用價值的抗性基因并在蔬菜抗逆基因工程中加以應(yīng)用已經(jīng)引

2、起了人們高度關(guān)注,成為國際生物學(xué)界當前十分活躍的研究領(lǐng)域。本研究選擇在蔬菜抗逆(病)反應(yīng)中可能起重要調(diào)節(jié)作用的辣椒疫霉激發(fā)子elicitin和大白菜乙烯應(yīng)答因子(BpERF1),運用原核表達、酵母雙雜交技術(shù)對兩個辣椒疫霉elicitin基因進行初步功能研究以及通過亞細胞定位、瞬間表達技術(shù)和轉(zhuǎn)基因煙草T2代抗逆分析研究大白菜BpERF1基因的功能,取得了以下研究結(jié)果:
　　 1.通過設(shè)計特異性引物和RT-PCR擴增,獲得了2個辣椒

3、疫霉elicitin基因的全長cDNA,其中elicitin7與大豆疫霉推定的elicitinSOJ3A有80％同源序列,elicitin24與辣椒疫霉capsicin有96％同源序列。上述2個elicitin激發(fā)子cDNA的推導(dǎo)氨基酸序列上均含有信號肽,都為酸性蛋白,都具有elicitin超家族保守的結(jié)構(gòu)域。進一步聚類分析,結(jié)果表明上述2個激發(fā)子都屬于α-elicitin。上述2個elicitin陽性克隆的原核表達產(chǎn)物都可誘導(dǎo)煙草K3

4、26產(chǎn)生過敏反應(yīng)。
　　 2.運用Gateway克隆技術(shù),以上述2個elicitin陽性克隆的cDNA為誘餌,構(gòu)建了用于酵母雙雜交的誘餌載體,3AT自激活檢測結(jié)果顯示這2個elicitin基因誘餌載體無自激活現(xiàn)象,其最低3AT濃度為50 mM。用上述2個誘餌載體篩選辣椒cDNA文庫,2個elicitin蛋白分別篩選到了1個和10個互作蛋白的陽性克隆,經(jīng)測序和同源性搜索,這11個陽性克隆分別是大豆冷調(diào)節(jié)基因類似蛋白(SRC2-li

5、ke protein)、泛素連接酶相關(guān)蛋白(SGT1)、β-微管蛋白(beta,tubulin)、長鏈脂酰輔酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase 6)、生長素抑制蛋白(auxin-repressed protein)、推定的線粒體磷酸運載蛋白(putative mitochondrialphosphate carder protein)、光合放氧復(fù)合物(photosystem Ⅱ oxygen-evo

6、lvingcomplex protein 3)以及4個未知功能的蛋白。這些蛋白分別與植物防御反應(yīng)、生長、鈣離子流,蛋白降解、細胞骨架構(gòu)成、脂肪酸代謝、光合作用以及呼吸作用有關(guān)。
　　 3.亞細胞定位結(jié)果顯示BpERF1是一個核定位蛋白,瞬間表達分析結(jié)果表明BpERF1可結(jié)合GCC盒,但不能與DRE元件結(jié)合。用BpERF1超表達煙草T2代株系的植株分析BpERF1超表達對轉(zhuǎn)基因煙草抗各種逆境脅迫的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BpERF1超表達對

7、轉(zhuǎn)基因植株耐高鹽、干旱和低溫等作用不明顯,但可增強轉(zhuǎn)基因植株對高溫的敏感性。人工接種辣椒青枯病病原菌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BpERF1超表達可提高轉(zhuǎn)基因煙草植株抗辣椒青枯病的水平,這與上述瞬間表達的結(jié)果即BpERF1可與GCC盒結(jié)合而不與DRE元件結(jié)合的結(jié)果是一致的,推測BpERF1可能主要參與對生物脅迫的防御反應(yīng)。
　　 4.鑒于BpERF1超表達可提高轉(zhuǎn)基因煙草對高溫的敏感性,本研究進一步分析了BpERF1超表達提高轉(zhuǎn)基因煙草對高溫敏感

8、性與活性氧代謝和細胞膜脂過氧化之間的可能關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草和對照均表現(xiàn)出MDA含量與APX活性呈上升趨勢,而SOD、CAT呈下降趨勢,POD活性則是呈先降后升的趨勢。但是,BpERF1超表達的轉(zhuǎn)基因植株中MDA量和H2O2的DAB染色顯示顯著高于野生型對照,而SOD、CAT和APX等活性氧清除系統(tǒng)都比對照低,POD活性在前期比對照高而后比對照低。這些結(jié)果表明BpERF1超表達提高轉(zhuǎn)基因植株對高溫敏感性可能與該基因超表達對活性氧代謝