白菜MtN3-saliva-SWEETs基因家族的鑒定及BcNS的功能分析.pdf

1、MtN3/Saliva/SWEETs domain又稱為PQ loop repeat，它包括一對重復，每個橫跨兩個跨膜螺旋，由一個loop連接。MtN3/Saliva/SWEETs基因家族進化過程中非常保守的，普遍存在于高等真核生物中，另外，在原生動物、后生動物、真菌、細菌、古生菌中也有報道。盡管近幾年來關于基因家族的成員陸續(xù)有被報道，但是確切的生化功能仍不清楚。隨著大白菜基因組測序的完成，使得在基因組水平上研究大白菜MtN3/Sali

2、va/SWEETs家族的信息已成為可能。本研究分離了29個大白菜MtN3/Saliva/SWEETs基因，研究該家族基因的分類、結構、染色體分布以及系統(tǒng)進化關系，分析其在大白菜不同組織以及花發(fā)育不同階段中的表達情況，并進一步通過定位分析和轉基因技術分析了家族成員BcNS的亞細胞定位和生物學功能。主要研究結果如下:
　　(1)利用在線數(shù)據(jù)庫進行查找，成功查找到29個白菜MtN3/Saliva/SWEETs基因。經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)全

3、長500～1000bp不等，編碼175～316個氨基酸，分子式量20～35kD，等電點7.59～9.62。除5號染色體外，其余染色體上都有家族基因的分布。分析啟動子順式作用元件發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)與光響應相關的元件。因此，MtN3/Saliva/SWEETs很可能參與植物的光合作用。通過跨膜區(qū)預測，所有成員都含有跨膜區(qū)域，并且有有23個成員編碼的蛋白質有7個跨膜區(qū)域，并且這些蛋白的膜外區(qū)域一般都非常短。但其膜內區(qū)高度保守，而跨膜區(qū)相對保守，并且

4、兩段高度保守的膜內區(qū)中各有一個可能的氨基酸磷酸化位點。上述結果表明，其膜內區(qū)是該類蛋白的重要功能區(qū)，其調控方式很可能是可逆的磷酸化/去磷酸化，受控于某一些蛋白激酶/磷酸酶。這一點可以成為MtN3/Saliva/SWEETs家族基因功能分析的一個重要切入點。進化分析表明，已有生理功能研究的基因在進化樹上處于相對較遠的分支，有可能在發(fā)育過程中起到各自獨立的作用。
　　(2)利用實時熒光定量PCR技術分析MtN3/Saliva/SWEE

5、Ts基因在大白菜不同組織及花發(fā)育過程中的表達情況。除了Bra021577、Bra016421、Bra026487、Bra025595、Bra009700、Bra035879六對引物擴出的9個基因成員幾乎不表達外，其他14對引物的20個擴增產(chǎn)物都有組織特異性，并且大多數(shù)表達差異都在100倍以上。白菜花發(fā)育不同階段中MtN3/Saliva/SWEETs基因的表達分析結果表明，不同MtN3/Saliva/SWEETs基因在不同花器官中表達水平

6、差異也非常明顯，且MtN3/Saliva/SWEETs基因家族主要參與白菜的生殖發(fā)育過程。
　　(3)將構建成功的pB7YWG2.0-BcNS-YFP過表達載體利用基因槍介導的洋蔥內表皮細胞瞬時表達的方法，對基因進行亞細胞定位分析。結果表明，BcNS ORF片段能夠在洋蔥表皮細胞的細胞膜中檢測到明顯的熒光信號，說明它可以在細胞膜中瞬時表達。膜上的蛋白質主要有載體蛋白、與細胞活動相關的離子泵、通道蛋白和蛋白受體等，暗示該基因可能對細