寄生疫霉Elicitin基因克隆、表達及Elicitin誘導(dǎo)植物抗病防衛(wèi)的機制研究.pdf

1、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文寄生疫霉Elicitin基因克隆、表達及Elicitin誘導(dǎo)植物抗病防衛(wèi)的機制研究姓名：梁元存申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：植物病理學(xué)指導(dǎo)教師：張?zhí)煊疃瓭h松2002.12.1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文摘要Phytophthora和eythium的許多種能向細胞外分泌一類小分子量的蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為elicitins。Elicitins在煙草上能引起過敏反應(yīng)(hypersensitiveresponse，HR)和系統(tǒng)獲得抗性(

2、systemicacquiredresistance，SAR)。Elicitins煙草互作體系是研究信號識別、信號傳導(dǎo)等諸多問題的良好體系。本論文報告作者對煙草寄生疫霉(Phytophthoraparasiticavarnicotianae)中國菌株的elicitin基因進行克隆、表達及其誘導(dǎo)植物抗病性方面的研究結(jié)果。根據(jù)己報道的寄生疫霉parAl基因的序列設(shè)計引物，從4株寄生疫霉不同寄主分離物(3株來自煙草，1株來自刺槐)中克隆到此基

3、因，序列分析表明4株寄生疫霉parAl基因序列高度保守。然后研究了parAl在大腸桿菌(Escherichiacoli)中的表達。對表達載體pET30a()X2酶切(NdeIBamHI)，構(gòu)建表達elicitin蛋白的表達載體pETeli，用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，通過IPTG誘導(dǎo)在大腸桿菌中產(chǎn)生的蛋白在煙草上引起過敏性壞死反應(yīng)。對重組蛋白性質(zhì)測定表明，重組蛋白有一定的耐熱性，并對蛋白酶K敏感。至此，我們已成功地從寄生疫霉

4、中國菌株中克隆到了parAl基因，并建立了大腸桿菌重組表達體系。在獲得重組蛋白的基礎(chǔ)上，測定了其誘導(dǎo)煙草和番茄對真菌、細菌和病毒病的抗病誘導(dǎo)作用。對不同濃度的elicitin進行誘導(dǎo)作用比較，此重組蛋白在30nM時。噴灑誘導(dǎo)煙草后產(chǎn)生最高的抗TMV的誘導(dǎo)作用：誘導(dǎo)作用可維持至少20天，其中在第4—5天誘導(dǎo)效果最好。因此，在elicitin誘導(dǎo)植物時，最好使用30nM濃度，并在誘導(dǎo)后第45天挑戰(zhàn)接種可產(chǎn)生最大的誘導(dǎo)效果。用30nM的eli

5、citin處理煙草和番茄，第4天接種測試的病原物，煙草經(jīng)誘導(dǎo)后，煙草能抗TMV(tobaccomosaicvirus)、煙草黑脛病菌∽parasitica)、煙草赤星病菌似lternarialongipes)和煙草青枯病菌(neudomonassolanacearum)，誘導(dǎo)作用分別是741％、638％、506％11450％：番茄經(jīng)誘導(dǎo)處理后抗青枯病(戶solanacearum)，誘導(dǎo)作用為431％。因此elicitin的抗病誘抗作用是