辣椒應(yīng)答疫霉的轉(zhuǎn)錄譜分析及相關(guān)候選抗病基因的cDNA分離.pdf

1、辣椒疫病(Phytophthora blight)是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici.Lone.)侵染引起的真菌性病害，是辣椒生產(chǎn)上一種毀滅性病害。研究辣椒疫病病原菌侵染誘導(dǎo)下的辣椒基因表達(dá)譜并分離、鑒定相關(guān)的候選抗病基因，對(duì)于闡明辣椒的抗病機(jī)制及其遺傳改良具有重要意義。本研究運(yùn)用cDNA-AFLP技術(shù)研究辣椒應(yīng)答疫霉菌侵染的轉(zhuǎn)錄圖譜，其中對(duì)363個(gè)衍生轉(zhuǎn)錄片段(transcript-derived fragmen

2、t TDF)測(cè)序并進(jìn)行了功能注釋，從由辣椒葉片提取的總RNA構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中篩選出3個(gè)全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。主要結(jié)果如下： 1、采用cDNA-AFLP技術(shù)，得到辣椒響應(yīng)疫霉差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄譜，并對(duì)圖譜中有差異變化的363個(gè)TDF測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行同源性分析，117個(gè)沒(méi)有找到同源序列，246個(gè)找到了同源序列，比例為67.8％，對(duì)TDF差異表達(dá)情況進(jìn)行分類發(fā)現(xiàn)無(wú)變化172個(gè)、各種下調(diào)(D)79個(gè)

3、、早期上調(diào)(E)28個(gè)、晚期上調(diào)(L)7個(gè)、其它形式上調(diào)(I)77個(gè)。這些基因主要有：小GTP結(jié)合蛋白，鈣依賴蛋白激酶，鐵氧還蛋白，抗壞血酸還原酶，類調(diào)滲蛋白，亞精胺合成酶，細(xì)胞色素P450，油酸脫氫酶，過(guò)氧化物酶，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。 2、采用SMARTTM cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，構(gòu)建了辣椒響應(yīng)疫霉cDNA文庫(kù)，其滴度達(dá)到了1×106pfu/mL，重組率達(dá)到90％以上。 3、采用基于PCR技術(shù)的96孔板cDNA文庫(kù)篩

4、選法，利用測(cè)序得來(lái)的基因片段設(shè)計(jì)引物，篩選cDNA文庫(kù)獲得了三個(gè)可能與抗病性密切相關(guān)：抗菌蛋白(EU401721)、Rubisco活化酶(EU401722)和硫堇蛋白(EU367112)的全長(zhǎng)cDNA。測(cè)序結(jié)果表明，抗菌蛋白全長(zhǎng)為645bp，含有長(zhǎng)度為85個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框，同源分析結(jié)果表明，所分離的cDNA與已發(fā)表的抗菌蛋白具有不同程度的同源性，抗菌蛋白(EU401721)與辣椒抗菌蛋白(AAL73184)同源性為98％，與苦瓜幾丁

5、質(zhì)酶(ABD66068)的同源性為57％，與秈稻(ABU25226)幾丁質(zhì)酶的同源性為60％，與銀合歡(AAM49597)幾丁質(zhì)酶的同源性為53％；Rubisco活化酶長(zhǎng)度為1741bp，含有長(zhǎng)度為439個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框，同源分析結(jié)果表明，Rubisco活化酶(EU401722)與西紅柿(AAC15236)Rubisco活化酶的同源性為92％，與馬鈴薯(ABX84141)Rubisco活化酶的同源性為81％；硫堇蛋白(EU36711

6、2)長(zhǎng)度為608bp，含有長(zhǎng)度為91個(gè)氨基酸的開(kāi)放讀碼框，同源分析結(jié)果表明，硫堇蛋白與辣椒(AAF16413)硫堇蛋白的同源性為71％。與辣椒(AF112443)硫堇蛋白的同源性為71％。 4、應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)三個(gè)候選基因在辣椒疫霉菌作用下的cDNA-AFLP分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并研究了它們?cè)诶苯芬呙?、UV-B、JA、SA、JA+SA、NaCl、4℃低溫和機(jī)械損傷等逆境或外源激素作用下的表達(dá)，結(jié)果表明：熒光定量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果