大豆疫霉轉(zhuǎn)錄因子PsCZF1、PsHSF1和PsMAD1的功能研究.pdf

1、大豆疫霉(Phytophthora sojae(Kaufman& Gerdman))已經(jīng)成為一種非常重要的植物病原菌，由其侵染大豆引起的疫霉根腐病是大豆生產(chǎn)中的毀滅性病害之一.長(zhǎng)期以來(lái)，由于大豆疫霉缺乏有效的遺傳操作系統(tǒng)，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育和致病性分子機(jī)理的研究非常少。隨著大豆疫霉全基因組測(cè)序的完成和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的逐步建立，大豆疫霉已經(jīng)成為研究卵菌分子遺傳的模式種。轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子，從研究轉(zhuǎn)錄因子的功能入手來(lái)解析大豆疫霉生長(zhǎng)發(fā)

2、育與致病性過(guò)程中的分子機(jī)制，對(duì)了解疫霉菌發(fā)育的分子生物學(xué)和致病性具有重要意義，可以為尋找新的疫霉殺菌劑作用靶標(biāo)，設(shè)計(jì)新的疫病控制策略提供理論依據(jù)。
　　 大豆疫霉C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子、熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor)和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)分析：轉(zhuǎn)錄因子在真菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病性方面有著重要的作用，對(duì)開(kāi)展大豆疫霉轉(zhuǎn)錄因子的研究提供了有益的參考。由于對(duì)大豆疫霉生長(zhǎng)發(fā)育和致病性

3、機(jī)理缺乏研究，大豆疫霉全基因組測(cè)序的完成為全面地分析其轉(zhuǎn)錄因子帶來(lái)了新的機(jī)遇。為了系統(tǒng)地研究大豆疫霉生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中轉(zhuǎn)錄因子的功能，本文周已知真菌轉(zhuǎn)錄因子對(duì)大豆疫霉全基因組進(jìn)行同源序列搜索，詳細(xì)分析了C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子、熱激轉(zhuǎn)錄因子和MADS-box轉(zhuǎn)錄因子這三類轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和基因組分布情況。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉共有90個(gè)C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子，20個(gè)熱激轉(zhuǎn)錄因子和1個(gè)MADS-box轉(zhuǎn)錄因子；C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子和熱激

4、轉(zhuǎn)錄因子在基因組上排列方式是豐富多樣的，有隨機(jī)分布的，也有幾個(gè)基因成簇排列的。生物信息學(xué)分析為后續(xù)基因功能研究提供了依據(jù)。
　　 PsCZF1在大豆疫霉生長(zhǎng)發(fā)育和致病過(guò)程中作用的研究：PsCZF1是一個(gè)編碼C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，該基因在已測(cè)序的卵菌中是高度保守的。將PsCZF1的預(yù)測(cè)啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合后轉(zhuǎn)化大豆疫霉得到穩(wěn)定表達(dá)GUS的轉(zhuǎn)化子，染色結(jié)果顯示GUS的活性在卵孢子階段最高，而且也受到侵染上調(diào)表達(dá)。為了詳細(xì)

5、研究PsCZF1的功能，本研究利用基因沉默技術(shù)，獲得了該基因的沉默突變體。PsCZF1沉默突變體的生長(zhǎng)速率與野生型相比下降了約50％，然而在菌絲細(xì)胞大小、孢子囊形態(tài)等方面與野生型菌株無(wú)顯著差異。沉默PsCZF1后嚴(yán)重影響了卵孢子形成、游動(dòng)孢子的產(chǎn)量和休止孢的萌發(fā)。接種結(jié)果顯示PsCZF1沉默突變體降低了對(duì)大豆的致病性。結(jié)果表明了卵菌特異的C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子PsCZF1在大豆疫霉的生長(zhǎng)發(fā)育和致病性中起著重要的作用。
　　 大豆疫

6、霉熱激轉(zhuǎn)錄因子PsHSF1參與應(yīng)答氧化壓力、熱激脅迫和致病性：PsHSF1編碼的蛋白質(zhì)含有HSF1DNA結(jié)合域。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PsHSF1與其有一定同源性的基因成簇排列在基因組上，其他卵菌中找不到序列上高度同源的基因。利用RT-PCR分析PsHSF1在無(wú)性生活史階段的表達(dá)情況，結(jié)果表明PsHSF1只在休止孢及其萌發(fā)階段表達(dá)，而且在萌發(fā)階段表達(dá)量顯著上調(diào)。同時(shí)，在過(guò)氧化氫脅迫下該基因受誘導(dǎo)表達(dá)。本文利用大豆疫霉遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和基因沉默技

7、術(shù)，獲得了PsHSF1基因沉默的突變體。PsHSF1基因沉默突變對(duì)過(guò)氧化氫和高溫處理變得敏感，但是不影響菌絲的正常生長(zhǎng)和孢子囊的產(chǎn)生。此外，PsHSF1的沉默顯著降低了休止孢的萌發(fā)率。致病性測(cè)定結(jié)果表明，PsHSF1沉默突變體的致病性顯著延緩。結(jié)果揭示了熱激轉(zhuǎn)錄因子PsHSF1參與了大豆疫霉抗氧化作用和致病過(guò)程。
　　 大豆疫霉MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的研究：PsMAD1編碼大豆疫霉MADS-boxDNA結(jié)合域的基因，該基因在其

8、他疫霉菌中高度保守，系統(tǒng)發(fā)育分析揭示了疫霉菌編碼MADS-box的基因與動(dòng)物肌細(xì)胞增強(qiáng)因子（myocyte enhancer factor, MEF）家族的親緣關(guān)系更近。利用RT-PCR方法和GUS報(bào)告基因，本研究詳細(xì)分析了PsMAD1在大豆疫霉生活史和侵染過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)，結(jié)果顯示PsMAD1在大豆疫霉無(wú)性生活史階段是組成性表達(dá)的，但在產(chǎn)孢菌絲、休止孢和萌發(fā)的休止孢時(shí)期表達(dá)量明顯提高，而且PsMAD1受侵染的誘導(dǎo)呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。對(duì)該