本氏煙轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1的抗疫霉病相關(guān)的功能研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是一類能夠特異性的與DNA序列結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定時(shí)間和空間上表達(dá)的蛋白質(zhì)，其主要的功能是激活或抑制下游基因的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子保守功能域DNA結(jié)合區(qū)(DNA-binding domain，DBD)的不同，可以將其劃分成不同的轉(zhuǎn)錄因子家族。近年來，對(duì)大量的植物轉(zhuǎn)錄因子研究發(fā)現(xiàn)，有些轉(zhuǎn)錄因子家族能夠直接或間接的參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)，如MYB家族、bZIP家族、ERF家族

2、和WRKY家族。這些轉(zhuǎn)錄因子的保守功能域通過與調(diào)控基因的啟動(dòng)子區(qū)相關(guān)順式元件的特異性結(jié)合，直接調(diào)控植物靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，或形成同源、異源二聚體，或與其他蛋白質(zhì)互作形成某種活化形式參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與植物抗病性相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過基因工程手段過表達(dá)植物抗病性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)抗性基因的表達(dá)，從而改善植物的綜合抗病能力。因此，抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究對(duì)植物抗病基因工程具有重要的意義。本文中，初步篩選到與本氏煙（N

3、icotiana benthamiana）植物抗病性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1，并進(jìn)一步研究了它們分別調(diào)控已知疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GmaPPO12的活性的情況，為植物抗病基因工程提供可能有價(jià)值的抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子。
　　本氏煙中抗疫霉病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1的篩選:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，挑選普通煙（Nicotiana tabacum）中受病原菌誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。利用同源比對(duì)的方法，在本氏煙基因組中分別尋找30個(gè)與其同源的轉(zhuǎn)錄

4、因子，包括WRKY家族、ERF家族和MYC家族。然后，對(duì)在疫霉誘導(dǎo)過程中上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子及其家族，進(jìn)一步利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Virus-induced gene silencing，VIGS)，對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行沉默。通過檢測基因的沉默效率，初步篩選到2個(gè)沉默效率超過50％的轉(zhuǎn)錄因子基因。
　　進(jìn)一步分別在沉默轉(zhuǎn)錄因子的本氏煙上，用辣椒疫霉P.capsici游動(dòng)孢子接種，在接種后0h、12h、24 h和36h，在手持紫外燈下

5、觀察細(xì)胞死亡情況，并統(tǒng)計(jì)病斑的大小。發(fā)現(xiàn)ERF基因沉默后，在侵染24h和36h時(shí)，與對(duì)照(pTRV2)相比，病斑面積比值分別是1.952和1.332; WRKY1基因沉默后，病斑面積比值分別是1.556和1.080。本氏煙對(duì)煙草疫霉的感病性增強(qiáng)，說明轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1可能參與了本氏煙疫霉抗性過程。
　　ERF和WRKY1調(diào)控已知的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GmaPPO12的活性:實(shí)驗(yàn)室前期研究證明，GmaPPO12基因啟動(dòng)子在疫霉誘導(dǎo)早

6、期能夠快速驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的上調(diào)表達(dá)，是疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，并證明它與植物的疫霉抗性相關(guān)。為了研究ERF和WRKY1轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控與已知的疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的活性，我們將該啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合，利用VIGS技術(shù)和煙草瞬時(shí)表達(dá)體系(Transient expression assays inNicotiana benthamiana)，檢測轉(zhuǎn)錄因子沉默后，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的GUS蛋白酶活、化學(xué)組織GUS染色以及GUS基因轉(zhuǎn)錄水

7、平的表達(dá)量，來探究轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1是否參與調(diào)控疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GmaPPO12的活性。結(jié)果表明，在本氏煙中沉默ERF和WRKY1基因，疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GmaPPO12驅(qū)動(dòng)GUS基因的活性降低，說明轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1分別參與了疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GmaPPO12的誘導(dǎo)表達(dá)。
　　通過上述的研究，我們?cè)诒臼蠠熤泻Y選到與植物抗病性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子ERF和WRKY1基因。并明確其參與調(diào)控已知的疫霉誘導(dǎo)型啟動(dòng)子GmaPPO12的