棉花WRKY轉(zhuǎn)錄因子GhWRKY39的分離及功能研究.pdf

1、環(huán)境脅迫（如病原菌侵害，土壤鹽害）對(duì)植物的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重的損害，而植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中形成了一系列用于調(diào)節(jié)自身生長(zhǎng)發(fā)育、抵御生物和非生物脅迫的機(jī)制。在眾多的適應(yīng)性機(jī)制中，基因表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在植物應(yīng)答環(huán)境信號(hào)刺激的反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子是其中最重要的一類調(diào)節(jié)基因，而WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)研究較為廣泛的植物特有的轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因啟動(dòng)子中的W-box結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)下游目的基因的表達(dá)，從而參與植物的防衛(wèi)反應(yīng)

2、及生長(zhǎng)發(fā)育等過程。大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)植物的生物脅迫和非生物脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。目前，有關(guān)WRKY的研究主要集中在擬南芥和水稻等模式植物中，而在重要經(jīng)濟(jì)作物棉花中研究較少。
　　本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum L.，魯棉22）為材料，通過同源克隆的方法分離得到一個(gè)WRKY家族基因，命名為GhWRKY39，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)功能分析。具體結(jié)果如下:
　　(1)序列分析表明，Gh

3、WRKY39的cDNA全長(zhǎng)1348bp，包括972bp的開放閱讀框，編碼一個(gè)含324個(gè)氨基酸的多肽，預(yù)測(cè)分子量為36.225kDa。GhWRKY39含有一個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)，并含有WRKYⅡd亞族的特征結(jié)構(gòu)C-region。進(jìn)化樹分析表明該基因與WRKYⅡd亞族的進(jìn)化關(guān)系最近，因其與AtWRKY39和BnWRKY39的相似性較高，因此命名為GhWRKY39。定量PCR的方法檢測(cè)該基因在棉花基因組中以單拷貝的形式存在。利用洋

4、蔥表皮進(jìn)行的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明GhWRKY39位于細(xì)胞核中。
　　(2)利用高效熱不對(duì)稱交錯(cuò)式PCR(hiTAIL-PCR)的方法分離得到一段包含1377bp的啟動(dòng)子片段。PlantCARE在線軟件預(yù)測(cè)該片段中含有多種順式作用元件，包括植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件及生物和非生物脅迫響應(yīng)元件。
　　(3)β-葡糖苷酸酶(GUS)活性分析實(shí)驗(yàn)表明G廳WRKY39能夠被病原菌和高鹽誘導(dǎo)表達(dá);定量PCR(qPCR)結(jié)果進(jìn)一步證明GhWRKY3

5、9的表達(dá)受生物脅迫和非生物脅迫的誘導(dǎo)。
　　(4)超表達(dá)GhWRKY39的本生煙與野生型相比表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌和真菌的抗性;轉(zhuǎn)基因植株中的幾個(gè)PR基因和NPR1基因的mRNA積累量均升高。
　　(5)細(xì)菌和真菌處理后，轉(zhuǎn)基因植株的H2O2積累量明顯少于野生型，其抗氧化酶(SOD，POD和CAT)的活性也高于野生型。
　　(6) GhWRKY39超表達(dá)植株對(duì)高鹽脅迫具有抗性，主要表現(xiàn)在:萌發(fā)期的轉(zhuǎn)基因株系的種子萌發(fā)率高于野生型