棉花GhWRKY3基因的分離及其表達(dá)特性分析.pdf

1、WRKY是一類主要存在于植物中的轉(zhuǎn)錄因子超家族。自Ishiguro和Nakamura從甘薯中分離到SPF1后,WRKY便開始得到廣泛的研究和關(guān)注,目前已經(jīng)從多種植物中分離出了WRKY基因并鑒定了其功能。許多研究表明,WRKY參與了植物體的多種生物學(xué)過程,尤其是在植物的抗病反應(yīng)中發(fā)揮了重要的作用。本研究以陸地棉為材料,從中克隆得到一個(gè)新WRKY基因即GhWRKY3,并對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)特性分析及初步的功能鑒定。具體結(jié)果如下:
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2、、根據(jù)同源蛋白設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,用RACE和RT-PCR的方法從陸地棉中克隆得到一個(gè)新的WRKY基因,即GhWRKY3,GenBank注冊(cè)號(hào)為FJ966887。GhWRKY3全長(zhǎng)1,705bp,包含72bp的5’非編碼區(qū)和109bp的3’非編碼區(qū),其開放閱讀框共1,524bp,編碼了一個(gè)含有507個(gè)氨基酸的多肽。序列分析發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白含有兩個(gè)典型的WRKY結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)(C-X4-C-X22-23-H-X1-H),并且含有一個(gè)核

3、定位信號(hào)序列PKRR,屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族第Ⅰ類成員。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn),該蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。GhWRKY3的基因組含有3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子,并且它的第3個(gè)內(nèi)含子位于羧基端的WRKY結(jié)構(gòu)域內(nèi)。
　　 2、用反向PCR和巢式PCR的方法擴(kuò)增出了該基因的部分啟動(dòng)子序列,共720bp,用PlantCARE在線軟件分析發(fā)現(xiàn),該啟動(dòng)子序列內(nèi)除含有典型的TATA-box,CAAT-box外,還含有ABA應(yīng)答元件,脅迫應(yīng)答元件,光應(yīng)答元件和

4、胚乳發(fā)育相關(guān)元件等。根據(jù)這些結(jié)果推測(cè),GhWRKY3可能在植物的脅迫應(yīng)答反應(yīng)中和生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮了一定的作用。
　　 3、半定量RT-PCR分析顯示,GhWRKY3在根莖葉中均有表達(dá),不具有組織特異性。GhWRKY3可以被多種信號(hào)分子包括水楊酸(SA)、脫落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯(ET)、赤霉素(GA3)和過氧化氫(H2O2)所誘導(dǎo),而在外源細(xì)胞分裂素6-BA,生長(zhǎng)素類似物NAA的脅迫下,其表達(dá)量沒有明顯的

5、變化。此外,GhWRKY3在真菌棉花枯萎病菌F.oxysporum f.sp.Vasinfectum、立枯絲核菌R.solani、炭疽菌C.gossypii和傷脅迫下表達(dá)量上升,而干旱(15％PEG6000)、高鹽(NaCl)和低溫(4℃),GhWRKY3的表達(dá)量沒有發(fā)生明顯的變化。根據(jù)這些結(jié)果,可以推測(cè)GhWRKY3可能在植物的抗病反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了一定的作用。
　　 4、構(gòu)建了GhWRKY3正義植物表達(dá)載體pBI121-

6、GhWRKY3,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,轉(zhuǎn)化本生煙草,PCR和RT-PCR鑒定分析表明GhWRKY3在煙草中成功表達(dá)。
　　 5、選取部分T0代轉(zhuǎn)基因植株的自交種子擴(kuò)增繁殖,得到T1代轉(zhuǎn)基因植株,在分子鑒定的基礎(chǔ)上,初步證明所選擇的株系的T1代轉(zhuǎn)基因植株種外源基因基本符合3:1的遺傳分離定律。選取兩株具有代表性的轉(zhuǎn)基因植物的T1代種子,對(duì)種子萌發(fā)和萌發(fā)早期幼苗的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了初步分析,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株萌發(fā)晚。進(jìn)一步分