棉花COL家族基因的鑒定、表達(dá)與進(jìn)化分析.pdf

1、棉花是全球性的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，植物學(xué)分類屬于被子植物門（Angiospermae）、雙子葉植物綱（Dicotyledoneae）、錦葵目（Malvales）、錦葵科（Malvaceae）、棉族（Gossypieae）、棉屬（Gossypium）。棉屬共50個(gè)種，包括45個(gè)二倍體及5個(gè)四倍體種。四倍體棉種包括3個(gè)野生棉，即毛棉、黃褐棉及達(dá)爾文氏棉，此外陸地棉和海島棉是目前世界上栽培面積最廣的兩個(gè)栽培種。栽培種由野生種馴化而成，由于長期栽

2、培、馴化及選擇作用，野生棉伴隨著對(duì)光周期敏感的多年生短日照生長習(xí)性轉(zhuǎn)變?yōu)楣庵芷诓幻舾械囊荒晟L習(xí)性。發(fā)掘棉花光周期相關(guān)基因，研究光周期開花途徑的作用機(jī)制，對(duì)于棉花適應(yīng)多樣性的環(huán)境及種植面積的擴(kuò)展十分有益。CO（CONSTANS）及COL（CONSTANS-LIKE）基因是調(diào)控植物光周期開花的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子。CO受上游生物鐘相關(guān)基因（GIGANTEA）G1的影響，并激活下游的成花素FT(FLOWERINGLOCUST)的表達(dá)。對(duì)于特定

3、基因或位點(diǎn)的選擇作用，會(huì)導(dǎo)致栽培種群體內(nèi)核酸多樣性水平降低、基因頻率的降低或升高而偏離中性期望及連鎖不平衡的增加。目前水稻中已經(jīng)證明COL基因是選擇的靶標(biāo)基因。鑒于COL家族基因在光周期開花途徑中的保守功能，棉花中COL家族基因信息的局限性以及馴化選擇中作用未知。本研究根據(jù)擬南芥、水稻的COL家族基因信息從全基因組水平分離棉花的COL家族基因，對(duì)其進(jìn)行分類、結(jié)構(gòu)特征、定位、組織表達(dá)、晝夜節(jié)律表達(dá)及分子進(jìn)化等系統(tǒng)分析，主要研究結(jié)果如下:<

4、br>　　1.利用比較基因組學(xué)，根據(jù)擬南芥、水稻的COL家族基因信息，比較雷蒙德氏棉數(shù)據(jù)庫，鑒定了23個(gè)棉花COL家族基因。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析，該家族基因分為3類，其中Ⅰ類基因包括COL1-8，均含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。AA分析顯示有2個(gè)B-box及1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域（COL8除外）;Ⅱ類基因包括COL9-11，也包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子，有1個(gè)B-box及1個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域;Ⅲ類基因包括COL12-23，該類基因包含一個(gè)完整的B-bo

5、x，一個(gè)分化的鋅指結(jié)構(gòu)及一個(gè)CCT結(jié)構(gòu)域。該類基因結(jié)構(gòu)比較多變，包括2個(gè)或3個(gè)內(nèi)含子。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究了20個(gè)COL家族基因在棉花TM-1根、莖、葉、花藥、花瓣等不同組織及0 DPA、10 DPA及20 DPA纖維發(fā)育不同階段的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，Ⅰ類中的八個(gè)基因中，COL1-5，COL8等六個(gè)基因在葉中高表達(dá)， COL6和COL7在花中優(yōu)勢表達(dá)。此外，COL2-5在纖維中表達(dá)也較高。Ⅱ類中三個(gè)基因均在葉

6、中優(yōu)勢表達(dá)。Ⅲ類中九個(gè)基因，除COL14、COL20及COL22分別在莖、葉及纖維中優(yōu)勢表達(dá)外，其余六個(gè)基因均是組成型表達(dá)。
　　3.在LD或SD條件下，分別處理陸地棉TM-1及海島棉H7124，連續(xù)48h取三葉一心期葉片進(jìn)行COL家族基因表達(dá)特征分析。結(jié)果顯示已分析的20個(gè)基因中有18個(gè)基因的表達(dá)表現(xiàn)為晝夜節(jié)律性，表明棉花COL家族基因參與棉花光周期調(diào)控的開花途徑，在棉花的光周期開花途徑中起重要作用。
　　4.選擇包括野生

7、棉、陸地棉及海島棉等25個(gè)棉材料及外類群長梗肖槿為研究材料，對(duì)CO/Hd1所在的Ⅰ類中8個(gè)基因進(jìn)行分子進(jìn)化相關(guān)分析。通過各基因基因組與cDNA進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明這8個(gè)COL基因非常保守，均含有兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。8個(gè)COL基因其DNA全長變異范圍為1，030bp-1，611bp，內(nèi)含子長度的變異范圍為77bp-680bp。通過比較不同棉種間同一亞組其同源基因的變異發(fā)現(xiàn)，COL2，COL6，及COL8在供試材料間的內(nèi)含子或外

8、顯子Ⅱ區(qū)發(fā)生插入/缺失，導(dǎo)致長度變異。而同一材料其A-及D亞組部分同源基因的結(jié)構(gòu)變異表明，COL4和COL7在外顯子Ⅰ或外顯子Ⅱ發(fā)生插入/缺失，導(dǎo)致At及Dt間長度變異。
　　5.系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，A組供體阿非利加棉與異源四倍體棉A亞組聚在一起，D組供體與異源四倍體棉D(zhuǎn)亞組聚為一類。184個(gè)成對(duì)比較中，其A vs.D、At vs.Dt成對(duì)比較的進(jìn)化速率高于A vs.At及D vs.Dt進(jìn)化速率占到98.37％。進(jìn)一步分析證明A v

9、s.D與At vs.Dt進(jìn)化速率之間表現(xiàn)極高的正相關(guān)，最小的相關(guān)系數(shù)r值為0.797。說明異源四倍體中，8個(gè)COL家族基因的A-及D-亞組間是獨(dú)立進(jìn)化的。
　　6.通過成對(duì)比較8個(gè)COL家族基因組合，以及每個(gè)基因在所有四倍體棉種及A、D基因組間的核酸多樣性（π）。結(jié)果表明8個(gè)基因組合中，D vs Dt核酸多樣性(0.01051)，顯著大于AvsAt的核酸多樣性(0.00586)(P=4.9E-21)。單個(gè)基因分析表明，COL2-C

10、OL5，COL7及COL8這6個(gè)基因在Dt中的進(jìn)化速率顯著快于At，COL6是在At的進(jìn)化速率顯著快于Dt，而COL1基因的進(jìn)化速率在At和Dt之間無顯著差異。綜上所述，8個(gè)COL家族基因在At及Dt間的進(jìn)化速率不同，大部分基因其Dt的進(jìn)化速率快于At。
　　7.分別分析野生棉、陸地棉及海島棉的8個(gè)COL基因位點(diǎn)其核酸多樣性πtotal，結(jié)果顯示野生棉的πtotal，顯著高于陸地棉(0.00369 vs0.00139)(P=0.0

11、01)及海島棉(0.00369 vs0.00035)(P=7.3E-7)，表明陸地棉及海島棉在馴化過程中存在瓶頸效應(yīng)。進(jìn)一步比較B-box，Var及CCT這三個(gè)結(jié)構(gòu)域在不同棉種中的核酸多樣性，發(fā)現(xiàn)B-box(0.00284 vs0.00119，P=0.028)及Var(0.00243 vs0.00119，P=0.014)結(jié)構(gòu)域的核酸多樣性顯著高于CCT結(jié)構(gòu)域，B-box及Var結(jié)構(gòu)域間的核酸多樣性無顯著差異。說明B-box及Var結(jié)構(gòu)域

12、在進(jìn)化過程中發(fā)生較大變異，而CCT結(jié)構(gòu)域在不同棉種間高度保守，功能上也比較保守。
　　8.通過對(duì)8個(gè)COL家族基因進(jìn)行Tajima's D，F(xiàn)u and Li's D和F中性檢驗(yàn)，表明陸地棉在COL1及COL2中存在大量的低頻率位點(diǎn)，這與陸地棉最近發(fā)生的正選擇作用相一致。COL8 Dt在陸地棉種中，F(xiàn)uand Li's D和F值在0.1水平上為顯著的正值，表明在COL8中存在大量中等頻率的等位基因，可能是由平衡選擇引起的。中性檢驗(yàn)