擬南芥AtLrgB基因的進化分析與功能研究.pdf

1、細菌的IrgA/B和cidA/B操縱子編碼胞壁質(zhì)水解酶調(diào)控因子，在細菌的自我分解機制中起重要作用．擬南芥基因組中有一個細菌IrgB基因的同源基因，稱之為AtLrgB。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因組中許多編碼肽聚糖合成酶的基因是缺失的，因此擬南芥細胞中沒有肽聚糖結構。同時，擬南芥中不存在編碼胞壁質(zhì)水解酶的基因，因此，AtLrgB基因在進化過程中功能發(fā)生了改變。本研究通過對AtLrgB突變體和過量表達體的表型觀察和分析，闡述了AtLrgB基

2、因在擬南芥生長發(fā)育中的功能。得到的主要結果如下：
　　 1．構建了AtLrgB-EGFP融合蛋白來分析AtLrgB蛋白的亞細胞定位．結果表明，AtLrgB蛋白位于葉綠體內(nèi)膜上，同時，構建了PAtLrgB:GUS啟動子報告株系。GUS的組織化學染色結果表明AtLrgB基因主要在擬南芥的地上部分表達，在根中不表達．并且，GUS的表達主要集中在幼嫩的組織中，在成熟葉片中其表達從葉尖到葉片基部逐漸消失，表明AtLrgB基因的啟動子受到的

3、調(diào)控類似于葉片從庫到源轉(zhuǎn)交的調(diào)控機制．對于AtLrgB基因在一個光周期內(nèi)表達量的實時定量PCR檢測結果表明，AtLrgB基因的表達受到晝夜節(jié)律的調(diào)控．
　　 2．T-DNA插入突變體αtlrgB-1植株與AtLrgB-RNAi轉(zhuǎn)基因植株都表現(xiàn)出淺綠的子葉和幼葉．當atlrgB-1突變體在培養(yǎng)基上生長到8天時，子葉的葉尖開始出現(xiàn)壞死，并且逐漸擴散，然后第一對真葉也出現(xiàn)壞死。將PAtLrgB:AtLrgB轉(zhuǎn)入突變體中進行表型彌補實驗

4、，結果證明突變體的表型與AtLrgB基因的T-DNA插入直接相關．
　　 3．通過構建35S:AtLrgB表達載體，獲得了AtLrgB過量表達的擬南芥轉(zhuǎn)基因純系。通過表型觀察，發(fā)現(xiàn)AtLrgB基因的過量表達導致了植株葉片萎黃和生長遲緩。
　　 4．觀察了野生型、atlrgB-1突變體和過量表達體葉片的葉綠體亞顯微結構。突變體和過量表達體的葉肉細胞中，葉綠體的類囊體結構都表現(xiàn)出稀疏的現(xiàn)象．a(chǎn)tlrgB-1突變體葉綠體中的淀

5、粉粒比野生型中大，并且數(shù)量更多；而在過量表達體中，淀粉粒很少甚至消失．維管束鞘細胞中，atlrgB-I突變體的葉綠體基本正常，而過量表達體的葉綠體較小，并且類囊體結構很少。
　　 5．測定了野生型、atlrgB-1突變體和過量表達體葉片的淀粉含量。結果表明突變體在白天比野生型累積了更多的淀粉，而過量表達體的淀粉累積量很少．同時，還測定了三種植株中蔗糖的含量。白天，突變體葉片中的蔗糖含量始終低于野生型；夜晚，突變體蔗糖含量先發(fā)生了

6、短暫的急劇增加，然后逐漸減少．對于過量表達體來說，白天葉片中的蔗糖含量基本與野生型相等，只是在光周期的最后階段略高于野生型；夜晚時分葉片中的蔗糖含量始終低于野生型。
　　 6．研究了培養(yǎng)基中不同蔗糖濃度對于atlrgB-1突變體和AtLrgB基因過量表達體表型的影響。在2％蔗糖濃度培養(yǎng)基上生長的atlrgB-1突變體植株相較于1％蔗糖濃度培養(yǎng)基上生長的植株，其葉片壞死出現(xiàn)得遲，并且壞死區(qū)域較少．而過量表達體在2％蔗糖濃度培養(yǎng)基上

7、生長時，表現(xiàn)出更嚴重的萎黃表型，同時，還發(fā)現(xiàn)外源的葡萄糖對于突變體與過量表達體的影響類似于蔗糖。這些結果說明突變體和過量表達體的異常表型與破水化合物的可獲得性是密切相關的．
　　 7、經(jīng)序列查找和比對，發(fā)現(xiàn)AtLrgB的同源蛋白在細菌和植物中是廣泛存在的．這些同源蛋白的LrgB結構域氨基酸序列比對結果表明，這一結構域在細菌和植物中是高度保守的．同時，將植物中同源基因的N端序列與原核生物的LrgA結構域進行了氨基酸序列的比對后發(fā)現(xiàn)

8、，這些基因的N末端與原核生物的LrgA結構域具有相似性，盡管這種相似性比LrgB結構域低．比對結果表明，從原核生物到真核生物的進化過程中，LrgA和LrgB基因發(fā)生了基因融合。
　　 8．構建了35S:AtLrgB-D1和35S:AtLrgB-D2過量表達體，表型觀察結果表明，單個LrgA結構域與LrgB結構域過量表達體都表現(xiàn)出35S:AtLrgB過量表達體的萎黃表型，同時，構建了PAtLrgB:AtLrgB-D1和PAtLrg