玉米逆境響應(yīng)相關(guān)基因ZmUBP的功能鑒定與WRKY基因家族進(jìn)化分析.pdf

1、玉米是我國種植面積最大的糧食作物。生物與非生物逆境脅迫嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)，抗逆育種已成為玉米遺傳改良的重要方向，因此發(fā)掘和研究抗逆相關(guān)基因及其功能并進(jìn)行分子育種，是培育抗逆新品種提高玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的一種有效途徑。泛素特異性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Protease, UBP）是一類廣泛存在于真核生物中的保守性很高的蛋白，它們通過脫泛素化作用調(diào)節(jié)生長發(fā)育。在植物抗逆過程中，UBP蛋白也有著重要的作用，但迄今關(guān)于玉

2、米中該蛋白基因家族的功能還未見報(bào)道。本研究通過對玉米基因組ZmUBP家族分析，克隆了玉米中 UBP14， ZmUBP16a，ZmUBP16b和 ZmUBP16c，并對這些基因的功能進(jìn)行了分析鑒定；同時(shí)對玉米及其他禾本科物種中抗逆相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了分子進(jìn)化的研究。獲得了以下主要結(jié)果：
　　1、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明，ZmUBP14和ZmUBP16a/b/c均含有UBP結(jié)構(gòu)域。組織表達(dá)模式分析顯示，它們在玉米生長的各個(gè)時(shí)期

3、都普遍表達(dá)。不同的非生物脅迫處理下，ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c能夠響應(yīng)脫落酸誘導(dǎo)、鹽離子及重金屬脅迫。通過構(gòu)建ZmUBP14-GFP和ZmUBP16a/b/c-GFP載體并轉(zhuǎn)化擬南芥，研究 ZmUBP14和 ZmUBP16a/b/c的蛋白定位，結(jié)果表明ZmUBP14-GFP融合蛋白定位在細(xì)胞核中，ZmUBP16a-GFP，ZmUBP16b-GFP和ZmUBP16c-GFP融合蛋白均定位在細(xì)胞膜上。
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4、、通過構(gòu)建ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c過表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化擬南芥 ubp16功能缺失突變體，結(jié)果顯示，這三個(gè)蛋白均能回補(bǔ)擬南芥 ubp16功能缺失突變體的表型。在擬南芥中分別過表達(dá)玉米ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c，分析表明，ZmUBP16a，ZmUBP16b和ZmUBP16c的過表達(dá)并不影響植株的抗鹽性，在經(jīng)100mM NaCl處理后，過表達(dá)植株的表型與空載體對照無明顯差異；在0.5μM

5、ABA的處理下，過表達(dá)植株的發(fā)芽率在比空載體對照低了約50％，過表達(dá)ZmUBP16a和ZmUBP16b的植株表現(xiàn)出對CdCl2明顯的不敏感性；因此說明，過表達(dá) ZmUBP16a，ZmUBP16b和 ZmUBP16c能夠提高了擬南芥對ABA的敏感性和對重金屬的抗性。
　　3、通過對抗逆相關(guān)基因的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)逆境條件下， ZmUBP16a， ZmUBP16b和 ZmUBP16c過表達(dá)植株中的抗逆功能基因的表達(dá)水平顯著提高，抗重金屬相

6、關(guān)基因如AtABCC1，AtABCC2和AtPCS在鎘處理后表達(dá)量明顯高于對照；ABA通路基因以及與ABA合成相關(guān)基因（如AtNCED3，AtMYB2，AtRD22）的表達(dá)量也明顯高于對照植株，而不依賴于ABA的抗逆基因AtCBF表達(dá)量變化不大。結(jié)果表明，ZmUBP16a, ZmUBP16b和 ZmUBP16c是通過ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與離子脅迫應(yīng)答。
　　4、為進(jìn)一步確認(rèn)ZmUBP16a在重金屬脅迫下的作用機(jī)制，本研究選取了野生

7、型以及 ZmUBP16a過表達(dá)植株在金屬鎘處理前后的植株樣品，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序，通過表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，ZmUBP16a過表達(dá)引起的上調(diào)基因中，大部分為代謝相關(guān)基因，包括糖代謝、能量代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝和核苷酸代謝，在重金屬鎘處理后，這些代謝相關(guān)基因在過表達(dá)和野生型植株中大多呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。在過表達(dá)和重金屬處理都能引起上調(diào)表達(dá)的有3個(gè)功能基因，其中AT1G05680是活性氧（ROS）和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中有重要的作用的基因。<

8、br>　　5、通過構(gòu)建ZmUBP14過表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化擬南芥ubp14功能缺失突變體。分析結(jié)果表明，過表達(dá)玉米ZmUBP14基因能夠回補(bǔ)擬南芥ubp14功能缺失突變體的表型。利用Pull-down分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)ZmUBP14和玉米抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZmTCP15a以及ZmTCP15b在體外存在互作；雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）技術(shù)分析也表明，ZmUBP14分別和 ZmTCP15a/b在植物體內(nèi)也存在互作關(guān)系。因此ZmUBP14可能是與ZmT