蒺藜苜蓿MtPUB基因克隆及進(jìn)化分析.pdf

1、U-box蛋白在植物中廣泛存在說明該類蛋白在植物體內(nèi)發(fā)揮重要作用。很多U-box蛋白具有泛素連接酶E3活性以及在泛素化過程中特異地識別靶標(biāo)蛋白等生理生化功能。AtPUB4蛋白是在擬南芥中最新發(fā)現(xiàn)的具有E3連接酶活性的PUB蛋白，研究表明AtPUB4基因能影響花粉絨氈層細(xì)胞的生長發(fā)育，利用其特性有可能創(chuàng)制溫敏型雄性不育材料。
　　蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是豆科苜蓿屬的一年生草本植物。二倍體，具有生育期短、基

2、因組小、自花授粉、易于轉(zhuǎn)化、再生時間較短等特點(diǎn)，被作為豆科模式植物進(jìn)行研究，2011年已完成全基因組測序。目前，有關(guān)蒺藜苜蓿U-box基因家族的研究尚未見報道。本試驗(yàn)克隆兩個蒺藜苜蓿U-box基因MtPUB1和MtPUB2，通過生物信息學(xué)及生物技術(shù)手段分析了克隆基因結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、原核表達(dá)及基因的表達(dá)特性，成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體對擬南芥進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。最后對MtPUB基因家族進(jìn)化過程進(jìn)行了分析。研究結(jié)果如下：
　　1.利用同源克隆

3、法獲得蒺藜苜蓿MtPUB1和MtPUB2基因，該基因cDNA全長2448和2400 bp，分別編碼815和799個氨基酸，蛋白分子量為88.36 KDa和87.96 KDa，兩個蛋白都是疏水性蛋白，無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)。
　　2.亞細(xì)胞定位預(yù)測MtPUB1基因定位在細(xì)胞質(zhì)，MtPUB2基因定位在線粒體基質(zhì)。構(gòu)建原核表達(dá)載體，獲得MtPUB1蛋白。
　　3.利用實(shí)時熒光定量PCR分析MtPUB1和MtPUB2基因在蒺藜苜蓿不同組

4、織的表達(dá)特異性，結(jié)果表明MtPUB1基因在花中表達(dá)量最高，MtPUB2在莖中表達(dá)量最高，兩個基因在根部表達(dá)量最低。MtPUB1在NaCl、PEG、ABA誘導(dǎo)后，表達(dá)量上升，低溫誘導(dǎo)表達(dá)量變化不明顯。MtPUB2在NaCl誘導(dǎo)后表達(dá)量下降，在PEG、ABA及低溫誘導(dǎo)下表達(dá)量都呈現(xiàn)出上升趨勢。
　　4.構(gòu)建植物表達(dá)載體 pBI121-MtPUB1和 pBI121-MtPUB2，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥Atpub4突變體，通過卡納抗性

5、篩選和PCR、RT-PCR檢測后，獲得MtPUB1的T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。經(jīng)過對轉(zhuǎn)化擬南芥突變體和野生型擬南芥花粉掃描電鏡觀測，花粉改變不明顯。
　　5.通過對MtPUB基因的功能歧化分析，U-box和ARM兩種功能結(jié)構(gòu)域的主要歧化位點(diǎn)位于3個保守的基序上，在此基礎(chǔ)上定位了9個歧化位點(diǎn)。
　　6.對MtPUB基因序列選擇壓力的分析結(jié)果表明，MtPUB基因在強(qiáng)的負(fù)選擇壓力下經(jīng)過復(fù)制后保留發(fā)揮基因功能，其中114個負(fù)選擇位點(diǎn)所