家犬嗅覺受體基因的空間表達(dá)差異及進(jìn)化分析.pdf

1、1991年,Linda和Richard首次在褐家鼠中發(fā)現(xiàn)了嗅覺受體(olfactory receptor)超基因家族,并因此獲得了2004年的諾貝爾生理學(xué)獎(jiǎng)。在近20多年的時(shí)間里,科學(xué)家們?cè)谄渌麆?dòng)物中也發(fā)現(xiàn)了大量的OR基因并對(duì)嗅覺系統(tǒng)的反應(yīng)機(jī)制做了詳細(xì)的闡述。家犬在15000前由狼馴化而來,家犬因其敏銳的嗅覺被用于追尋獵物、尋找毒品爆炸物等眾多領(lǐng)域。作為人類的伙伴,家犬的OR基因得到了大家的廣泛研究。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)1400多個(gè)家犬O

2、R基因分為17個(gè)家族,其中ClassI有4個(gè)家族,其余的13個(gè)家族都屬于ClassⅡ。家犬的OR基因家族中假基因占OR基因總數(shù)的20％左右,與鼠類的假基因率相近,但遠(yuǎn)低于人類等嗅覺差的哺乳動(dòng)物?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)One-ONS,One-OR的表達(dá)模式是嗅覺受體細(xì)胞所特有的,并且發(fā)現(xiàn)OR基因在主要嗅覺粘膜(MOE)上呈帶狀分布。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Family1不同亞家族的8個(gè)基因(cOR1A3、cOR1P2、cOR1X2、cOR1R4、OR1L6、OR1E

3、1、OR1K1、OR1I1)進(jìn)行了基因和氨基酸序列的分析并構(gòu)建了它們與不同哺乳動(dòng)物間的進(jìn)化樹,通過同源建模預(yù)測了氨基酸的三維結(jié)構(gòu),探討OR基因保守性與序列的關(guān)系。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)嗅覺粘膜LF、LB、RF和RB四個(gè)部位的8個(gè)OR基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了比較,說明了OR基因表達(dá)的空間差異性。本實(shí)驗(yàn)采用了SYB Green熒光染料的方法檢測PCR反應(yīng),并通過2-△△CT法來計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)定量的數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS19.0分析了8個(gè)OR

4、基因之間表達(dá)的相關(guān)性,旨在說明OR與上萬種氣味受體結(jié)合的復(fù)雜模式。
　　本次實(shí)驗(yàn)以來自山東曲阜的農(nóng)村土狗作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,以RT-PCR的方法克隆了8個(gè)目的基因cDNA的部分序列(150bp-300bp),與GeneBank的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)相似度為100%。首先對(duì)8個(gè)OR基因的堿基全序列進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示GC含量較高有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu),每個(gè)OR基因都有堿基插入,可能是OR家族基因形成進(jìn)化的主要方式。應(yīng)用BioMix分析了氨基酸序列,OR

5、具有8.0以上的高等電點(diǎn)可能與膜電位傳輸有關(guān),其中亮氨酸(L)的含量非常高,而L對(duì)α螺旋形成有巨大的推動(dòng)作用。氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)了兩段保守序列TMⅠ前端的EFLLLGL和TMⅥ后端的VVTPMLNPFIYSLRN,三維結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示TMⅥ之后的這段保守序列是在OR中都存在的一段短α螺旋。8個(gè)OR氨基酸比對(duì)分析顯示相似度為58.9%,這些都說明了OR具有較高的保守性。而高變的TMⅢ、TMⅣ和TMⅤ形成的兜狀結(jié)構(gòu)可能是氣味分子的結(jié)合區(qū)域。使用

6、MEGA5.0對(duì)家犬8個(gè)OR基因和大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)、貓(Felis catus)、人類(Homo mulatta)、牛(Bos Taurus)、馬(Equus caballus)、羊(Ovis aries)等哺乳動(dòng)物的同源基因進(jìn)行了序列比對(duì),使用最大似然法構(gòu)建了進(jìn)化樹。結(jié)果顯示,家犬、貓和大熊貓的親緣關(guān)系較近,并且推測OR基因進(jìn)化與食性有關(guān),一方面為大熊貓屬于食肉目提供了理論支持,另一方面也說明了O

7、R基因在進(jìn)化中的保守性。
　　本實(shí)驗(yàn)通過熒光定量PCR對(duì)8個(gè)OR基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示:OR基因在1＃、2＃、3＃、5＃、6＃樣本的MOE前端的表達(dá)量要高于后端的表達(dá)量,說明粘膜前端是主要的嗅覺感受區(qū);4＃個(gè)體的OR基因在MOE后端的表達(dá)量高,結(jié)合過去的研究我們推測嗅覺粘膜的后端可能是主要的低濃度氣味識(shí)別區(qū)。左右兩側(cè)的MOE的OR基因表達(dá)也有較大差異,一方面差異可能主要是由于間歇性的鼻息方式?jīng)Q定的,另一方面這種差異也

8、為辨別氣味的方向起到了重要作用。由于OR識(shí)別氣味分子的方式不只是一對(duì)一的簡單模式,而是也有通過復(fù)雜的OR組合來識(shí)別氣味的方式。我們假設(shè)實(shí)驗(yàn)的8個(gè)OR目的基因間存在這種組合模式,對(duì)相對(duì)表達(dá)量的數(shù)據(jù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果顯示,其中有四對(duì)OR基因的相關(guān)性極顯著,推測他們可能作為特定的組合模式來識(shí)別氣味。
　　家犬OR基因和氨基酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性保證了這一與食性相關(guān)的基因的保守性,OR基因在MOE不同部位的表達(dá)差異以及識(shí)別氣味的OR組合模式則