棉花GhMAPKK6基因的分離及其功能分析.pdf

1、植物依靠高度敏感的應(yīng)答機(jī)制適應(yīng)環(huán)境的變化，將環(huán)境中不利的脅迫信號傳遞入細(xì)胞內(nèi)，調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，啟動防御機(jī)制。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化和去磷酸化修飾在將細(xì)胞外信號傳遞入細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞內(nèi)信號傳遞途徑中起到了關(guān)鍵性作用。MAPK級聯(lián)信號傳遞途徑與植物的生長發(fā)育和非生物脅迫、病原物的侵染、植物激素等各種刺激反應(yīng)相關(guān)聯(lián)。
　　棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，不利的環(huán)境因素會嚴(yán)重影響其生長和產(chǎn)量。因此研究棉花中響應(yīng)脅迫信號傳遞的機(jī)制，利用分子手段改良棉花

2、，提高棉花的抗逆性具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。本研究以陸地棉（Gossypium hirsutum L.）（魯棉22）為材料，利用同源克隆的方法從棉花中克隆到一個新的MAPKK基因，通過序列對比、蛋白亞細(xì)胞定位分析、基因表達(dá)特性分析和功能分析等實(shí)驗(yàn)對其生物學(xué)功能進(jìn)行初步探索，具體結(jié)果如下:
　　(1)根據(jù)植物中A組MAPKK同源序列設(shè)計(jì)簡并引物，通過RACE-PCR的方法分離到一個MAPKK基因?；蛉蛄袦y定表明，該基因cDN

3、A全長有1284個核苷酸，包括1062bp的開放閱讀框，50bp的5'非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)和172bp的3'UTR。開放閱讀框編碼一個352個氨基酸的多肽，預(yù)測其分子量大約為39.868kDa。該蛋白擁有MAPKK家族特有的基序，與擬南芥AtMKK6、水稻的的OsMEK1同源性最高，因此命名為GhMKK6。疏水性分析表明該蛋白有跨膜區(qū)域，亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　(2)獲

4、得GhMKK6基因組序列與其cDNA序列比較后發(fā)現(xiàn)，該基因含有7個內(nèi)含子，內(nèi)含子的位置和個數(shù)都與已知的A組MAPKK相同，并且第5個內(nèi)含子都位于基因磷酸化位點(diǎn)內(nèi)部。利用反向PCR的方法獲得了GhMKK6基因的啟動子序列，軟件分析顯示該區(qū)域存在很多響應(yīng)環(huán)境脅迫的作用因子。
　　(3) RT-PCR結(jié)果表明，GhMKK6轉(zhuǎn)錄水平受機(jī)械損傷、高鹽、干旱等非生物脅迫，炭疽病菌和棉花枯萎病菌等生物脅迫以及ABA、SA、MeJA等多種信號分子

5、的誘導(dǎo)而提高，以上結(jié)果證明GhMKK6可能在棉花自身防衛(wèi)反應(yīng)過程中起到重要作用，而且參與到多個信號通路。
　　(4)將GhMKK6構(gòu)建超植物表達(dá)載體pBI121-GhMKK6,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化煙草（Nicotiana benthamiana）。經(jīng)過PCR鑒定證明GhMKK在轉(zhuǎn)基因煙草中已成功得到表達(dá)。
　　(5)我們用超表達(dá)GhMKK6的轉(zhuǎn)基因煙草和轉(zhuǎn)空載體的煙草T2代做功能分析。結(jié)果表明超表達(dá)GhMKK6的T2代轉(zhuǎn)