棉花RNA依賴的RNA聚合酶6(GhRDR6)基因的分離及功能分析.pdf

1、植物RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RDR）最早在中國卷心菜中發(fā)現(xiàn)，后從多種植物中分離出來。研究發(fā)現(xiàn)，RDR以細胞或病毒RNA為模板合成短的cRNA，參與序列特異的dsRNA誘導的基因沉默及抗病毒途徑。在擬南芥中RDR有6個同源基因：RDR1、RDR2、RDR3a、RDR3b、RDR3c、RDR6。本文以重要的經濟作物棉花（Gossypium hirsutum L.Cv.Lumian

2、22）為實驗材料，首次從棉花中克隆得到RDR6基因，并進行了序列比對、表達特異性分析、超表達轉基因抗病毒分析及生長發(fā)育等相關鑒定，為進一步明確RDR6的功能及作用機理奠定了理論基礎。主要的研究結果如下：
　　 （1）利用RT-PCR和RACE-PCR的方法，從棉花中克隆得到一個RDR基因，并命名為GhRDR6（GenBanK注冊號：GQ254649）。該基因全長4183bp，包括3591bp的開放閱讀框（ORF）,331bp的5

3、′非編碼區(qū)（5′UTR）和261bp的3′非編碼區(qū)（3′UTR），編碼一條含有1196個氨基酸的多肽，預測分子量為138.225kDa。同源序列分析發(fā)現(xiàn)，GhRDR6含有全部的RDR家族的功能區(qū)，并存在典型的保守基序DbDGD（b代表任一殘基），它是二價陽離子結合并產生催化活性的位點。進一步分析發(fā)現(xiàn)GhRDR6與擬南芥AtRDR6，普通煙NtRDR6和水稻OsRDR6同源性較高，分別達到了66％，66％和56％，而與棉花RDR1的同源性

4、僅僅31％。cDNA序列與基因組（GenBank注冊號:GQ254651）序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因中含有兩個內含子，其中一個位于5′UTR中。Southern blot實驗證明該基因在棉花基因組中以單拷貝形式存在。
　　 （2）利用半定量RT-PCR的方法，研究了GhRDR6基因在不同表達部位及多種非生物脅迫下的mRNA水平的表達特異性。結果表明，GhRDR6基因在根系中的表達量要明顯高于在莖、葉中的表達，推測可能參與根系的生長。在

5、水楊酸（SA）、過氧化氫（H2O2）和6-芐氨基嘌呤（6-BA）誘導下，該基因表達量沒有明顯變化，但是在赤霉素（GA）、茉莉酸（JA）、乙烯（5mM乙烯利，ET）、萘乙酸（NAA）、茉莉酸甲酯（MeJA）、脫落酸（ABA）、鹽、冷和傷等處理下mRNA水平表達量較高。推測該基因可能參與多種激素誘導途徑。
　　 （3）將GhRDR6 cDNA序列連入表達pBI121，構建正義表達載體，采用農桿菌介導的方法，轉化本生煙（Nicotia

6、na benthamiana），同時轉化空載體為對照。經卡那霉素篩選獲得若干植株。經PCR和Northern blot分析，證明該基因在轉基因煙草中成功表達。選取兩個鑒定好的T0代轉基因植株進行自交繁育，得到T1代，對T1代進行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)兩個株系均符合3:1的分離規(guī)律。繼續(xù)進行自交繁育，得到T2代轉基因植株，進行Northern bolt實驗，證明棉花RDR6基因成功表達。
　　 （4）轉基因植株根的相對生長情況發(fā)現(xiàn)，轉基因

7、植株在3周時比野生型植株根相對增長1-2cm，但是6周時這種區(qū)別不明顯了。在經過ABA處理后轉基因植株根相對增長2-2.5cm；在JA、MeJA和GA處理后轉基因植株的根較野生型分別增長1-1.5cm和1.5-2cm，而在經過6-BA、NAA、NaCl、甘露醇（Mannitol）和PEG處理后，轉基因植株根沒有明顯變化。對轉基因種子的萌發(fā)率實驗中，發(fā)現(xiàn)它與野生型植株并沒有明顯的區(qū)別。
　　 （5）抗病毒實驗中，接種PVY病毒后，

8、轉基因植株對PVY病毒表現(xiàn)出明顯的抗性。DAB染色分析發(fā)現(xiàn)，轉基因植株中H2O2的積累量明顯低于野生型。半定量RT-PCR分析兩種植株中病毒CP基因表達量發(fā)現(xiàn)，轉基因植株中CP基因表達量明顯低于野生型，而且轉基因植株中NPR1基因的表達量高于野生型。在轉基因抗病中還發(fā)現(xiàn)Osmotin基因在轉基因植株中表達量增加，而PR4基因表達量下降，但是 NbACOI和NbPR1a基因表達量沒有明顯變化。
　　 （6）轉基因植株的抗逆境脅迫研