綿羊痘病毒GY株的分離鑒定及靶向其RNA聚合酶基因siRNA的篩選.pdf

1、綿羊痘病毒(Sheep poxvirus，SPPV)、山羊痘病毒(Goat poxvirus，GTPV)和疙瘩皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）為痘病毒科(Poxviridae)，脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)，羊痘病毒屬(Capripoxvirus，CaPV)成員，可分別感染綿羊、山羊和牛，引起綿羊痘、山羊痘和牛結(jié)節(jié)性疹塊病。近年來，綿羊痘在我國多地發(fā)生，大量綿羊患病死亡，

2、給養(yǎng)殖業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。SPPV的基因組在侵入宿主細(xì)胞前由衣殼保護(hù)，衣殼在病毒侵入宿主細(xì)胞后，在適當(dāng)?shù)臅r間和位置被內(nèi)在的環(huán)境所解離，使病毒基因組快速釋放到細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制。因此，SPPV能否在細(xì)胞中增殖的一個決定因素就是病毒能不能脫去衣殼。脫殼過程依賴于RNA和蛋白質(zhì)的合成。目前，引起綿羊痘病毒脫殼的脫殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能及其編碼基因，以及轉(zhuǎn)錄脫殼蛋白的RNA聚合酶亞基尚不知曉。本研究在成功分離鑒定一株綿羊痘病毒的基礎(chǔ)上，初步進(jìn)行了綿

3、羊痘病毒RNA聚合酶基因的干擾的研究，為探究RNA聚合酶與脫殼的相關(guān)性奠定了基礎(chǔ)。
　　取發(fā)病綿羊的皮膚痘疹研磨制成病料樣品懸液，將該懸液感染未免疫綿羊，同時接種原代羔羊睪丸(LT)細(xì)胞，盲傳5代后，轉(zhuǎn)接Vero細(xì)胞，進(jìn)行間接免疫熒光和PCR鑒定。樣品懸液感染未免疫綿羊后出現(xiàn)羊痘典型發(fā)病癥狀，經(jīng)過LT細(xì)胞傳代后轉(zhuǎn)接Vero細(xì)胞，出現(xiàn)了特征性細(xì)胞病變，免疫熒光和PCR均檢測出病毒存在。PCR產(chǎn)物核酸序列測定結(jié)果顯示，分離毒株的基因片

4、段與已發(fā)表的綿羊痘病毒毒株的相應(yīng)基因片段同源性在99％以上。上述結(jié)果表明，本研究從寧夏固原疑似羊痘病毒感染的綿羊中成功分離到1株SPPV，命名為SPPV GY株。
　　以GY株基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得ORF051和ORF065基因，并對其生物學(xué)進(jìn)行分析，確定了其穩(wěn)定性和保守性，為設(shè)計靶向siRNA提供理論基礎(chǔ)。采用設(shè)計軟件siDirect version2.0進(jìn)行siRNA的設(shè)計和初步評估，盡可能的規(guī)避脫靶效應(yīng)，為兩條目的

5、基因分別最終確定選用3個siRNA作為進(jìn)一步實驗驗證的靶標(biāo)分子。
　　構(gòu)建表達(dá)目的基因的重組pEGFP-N1載體，轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞確定48h熒光表達(dá)量最高；siRNA分別與靶向目的基因的重組pEGFP-N1載體共轉(zhuǎn)染，確定6條siRNA均有抑制作用，且其中靶向SPPV ORF051基因的siRNA2與靶向SPPV ORF065基因的siRNA3效果最好。
　　以GY株病毒接種至Vero細(xì)胞，間隔8h收取培養(yǎng)液和細(xì)胞，以此建立了

6、病毒一步生長曲線。由一步生長曲線確定最佳收毒時間為88h。將目的基因重組于plv-puro載體，通過嘌呤霉素加壓篩選建立了SPPV-ORF051和SPPV-ORF065穩(wěn)定表達(dá)的Vero細(xì)胞系。
　　本研究采用生物信息學(xué)系統(tǒng)分析羊痘病毒的RNA聚合酶基因SPPV-ORF051和SPPV-ORF065，確定了其作為siRNA靶向抑制分子的可行性。病毒一步生長曲線的建立有助于了解病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)感染的動力學(xué)，同時為本研究中的RNA干擾