山羊痘病毒感染細(xì)胞microRNAs的篩選、鑒定及其在早期診斷中的應(yīng)用初探.pdf

1、microRNAs（miRNAs）是一類長度約為22nt的非編碼小RNA分子，可以通過結(jié)合靶基因信使RNA（messager RNA，mRNA）的3'UTR，5'UTR甚至蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，影響mRNA的穩(wěn)定性或抑制mRNA的翻譯過程，從而調(diào)控靶基因所參與的細(xì)胞生物學(xué)過程。已有多項(xiàng)研究表明宿主細(xì)胞miRNA可以在不同水平上調(diào)控感染相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)控病毒的生命周期。但是關(guān)于miRNA在痘病毒感染方面的研究較少，本實(shí)驗(yàn)以山羊痘病毒（Goatp

2、ox virus，GPV）作為研究對(duì)象，探究宿主細(xì)胞miRNA在山羊痘病毒感染過程中的作用。
　　本論文采用Illumina/Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)山羊痘病毒侵染的綿羊睪丸(Lamb Testicle，LT)細(xì)胞進(jìn)行miRNA測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行了質(zhì)量檢測(cè)和長度分布統(tǒng)計(jì)，篩選出差異性表達(dá)的miRNA分子。在此基礎(chǔ)上，采用定量PCR方法描述目的miRNA分子mir-365-3p和mir-365-5p在感染不同時(shí)期表達(dá)水平變化

3、。通過TargetScan靶基因預(yù)測(cè)、Gene Onthology(GO)注釋分析以及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)信號(hào)通路富集分析，探索mir-365-3p和mir-365-5p在GPV感染過程中可能行使的功能。之后還探究了mir-365-3p和mir-365-5p作為山羊痘病毒感染早期分子診斷標(biāo)記的可能。主要結(jié)果如下:
　　(1)制作LT原代細(xì)胞，并測(cè)定山羊痘病毒GH

4、株TCID50=10-467/100μL。
　　(2)檢測(cè)了山羊痘病毒感染4h的LT細(xì)胞中miRNA合成途徑中關(guān)鍵蛋白Dicer和Argonaute-2(AGO-2)的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Dicer蛋白呈上調(diào)趨勢(shì)，而AGO-2表達(dá)狀態(tài)無明顯改變。
　　(3)本研究通過Illumina/Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定了GH株山羊痘病毒感染LT細(xì)胞4h后宿主細(xì)胞的小RNA轉(zhuǎn)錄組，總共鑒定出91個(gè)差異性表達(dá)的miRNAs，其中47個(gè)

5、為綿羊新發(fā)現(xiàn)的miRNAs。與未感染組相比，這些差異性表達(dá)的miRNAs分子中，有48個(gè)miRNAs下調(diào)，43個(gè)miRNAs上調(diào)。
　　(4)檢測(cè)了在山羊痘病毒感染0-48h期間，mir-365-5p和mi-365-3p的表達(dá)情況:mir-365-5p主要呈下降趨勢(shì)，而mir-365-3p則是在0h-10h之間呈上升趨勢(shì)，10h-48h呈下降趨勢(shì)。
　　(5)利用TargetScan對(duì)mir-365-5p和mir-365-3

6、p的靶基因預(yù)測(cè)，共得到mir-365-5p的靶基因131個(gè)，mir-365-3p的靶基因275個(gè)。通過基因本體論GO分析發(fā)現(xiàn)mir-365-3p靶基因分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合，核酸結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子活性，其生物學(xué)過程主要富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞基礎(chǔ)代謝過程。而mir-365-5p靶基因分子功能主要蛋白質(zhì)結(jié)合，其生物學(xué)過程主要富集于蛋白質(zhì)代謝過程。通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)mir-365-3p的靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集于細(xì)胞骨架調(diào)控、趨化因

7、子信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，而mir-365-5p的靶基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集于泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解信號(hào)通路和ErbB信號(hào)通路。
　　(6)人工接種山羊痘病毒GH株于綿羊肋部表皮和大腿內(nèi)側(cè)表皮，感染3天后檢測(cè)肝臟、肺臟、瘤胃和皮膚的mir-365-5p和mir-365-3p的表達(dá)情況。結(jié)果表明，mir-365-3p在肝臟、肺臟