玉米R(shí)NA聚合酶Ⅲ識(shí)別的啟動(dòng)子活性鑒定與Waxy1基因編輯.pdf

1、基因組編輯是一種新近發(fā)展的在受體基因組中人工定向產(chǎn)生插入、刪除和替換等突變的技術(shù)?；诔纱氐囊?guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（ clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）的基因編輯技術(shù)因操作簡(jiǎn)便、設(shè)計(jì)靈活和突變效率高等特點(diǎn)，成為基因編輯的主流技術(shù)，并在玉米等高等植物定向遺傳改良提供了新途徑。然而，玉米中可用于表達(dá) sgRNA的 polⅢ啟動(dòng)子未得到系統(tǒng)鑒定，

2、限制了 CRISPR-Cas9技術(shù)在玉米中的應(yīng)用。本研究擬建立一套玉米瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，用以系統(tǒng)評(píng)估玉米多個(gè) RNA polⅢ啟動(dòng)子在 CRISPR-Cas9技術(shù)系統(tǒng)中的活性，為高效玉米基因編輯技術(shù)體系提供關(guān)鍵遺傳元件，并基于鑒定的高活性的RNA polⅢ啟動(dòng)子建立了玉米CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)體系，應(yīng)用于玉米ZmWaxy1基因的基因敲除編輯。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）建立了一套穩(wěn)定高效的玉米瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)。以鄭58、B7

3、3、中單99、自交系Black Mexican Sweet（BMS）等品種（系）的二葉期葉片為材料，采用酶解法進(jìn)行了玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體制備，獲得的原生質(zhì)體細(xì)胞通過(guò)FDA染色鏡檢，結(jié)果表明，基于本技術(shù)體系可以高效制備鄭58、B73、中單99、自交系Black Mexican Sweet（BMS）等品種的高活性葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體。通過(guò)對(duì)PEG介導(dǎo)的外源表達(dá)DsRed-2標(biāo)記基因表達(dá)載體試驗(yàn)對(duì)PEG濃度等參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳轉(zhuǎn)化效率

4、的PEG濃度為45％。本研究建立了轉(zhuǎn)化效率高達(dá)80%的玉米葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體的技術(shù)體系。
　?。?）建立了高效的CRISPR-Cas9基因編輯離體The Traffic Light Reporter（TLR）報(bào)告系統(tǒng)。本研究中TLR報(bào)告系統(tǒng)設(shè)計(jì)由兩個(gè)串聯(lián)的移碼突變的eGFP和DsRed報(bào)告基因，依據(jù)CRISPR-Cas9系統(tǒng)特點(diǎn)在設(shè)計(jì)的TLR系統(tǒng)前加入一段CRISPR-Cas9系統(tǒng)識(shí)別序列作為突變位點(diǎn)。在原生質(zhì)體中當(dāng) TLR系統(tǒng)被C

5、RISPR-Cas9編輯后，引入的突變可以分別引起移碼eGFP和DsRed報(bào)告基因回復(fù)突變，并分別在胞內(nèi)顯示綠色與紅色熒光，從而流式細(xì)胞計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)突變率。
　?。?）玉米R(shí)NA PolⅢ啟動(dòng)子分離及其CRISPR-Cas9活性鑒定。于玉米全基因組中搜尋U6 snRNA所在物理位置，取基因上游400-500 bp為U6 snRNA潛在的啟動(dòng)子序列，通過(guò)比對(duì)篩選我們共找到6個(gè)潛在的玉米U6 snRNA啟動(dòng)子。采用PCR法成功分離這6個(gè)預(yù)

6、測(cè)的啟動(dòng)子，并基于本研究建立的高效瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)與離體的TLR報(bào)告系統(tǒng)，鑒定了這些啟動(dòng)子的CRISPR-Cas9活性，鑒定出玉米中高活性的RNA PolⅢ啟動(dòng)子，并用于CRISPR-Cas9后續(xù)試驗(yàn)。
　?。?）以ZmWaxy1基因?yàn)榛蚓庉嫷哪繕?biāo)基因，選擇該基因ZmWaxy1基因的第7外顯子上構(gòu)建了人工定向編輯CRISPR-Cas9載體。
　?。?） ZmWaxy1基因敲除基因編輯。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，對(duì)玉米進(jìn)行CRISPR-

7、Cas9基因編輯載體的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。采用PCR法篩選得到36個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系，通過(guò)對(duì) T0代植株測(cè)序并對(duì)靶基因目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行了基因突變分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，36株轉(zhuǎn)基因植株中，純合突變?yōu)?3株，雙等位基因突變12株，雜合突變0株，野生型1株，突變率為97.22%。將T0代與野生型植株進(jìn)行雜交得到 T1代籽粒，所得到的籽粒經(jīng)過(guò)碘染色大部分表現(xiàn)出糯性性狀特性，表明CRISPR-Cas9在子代中表現(xiàn)出了較高的編輯效率。T0、T1代籽粒胚乳淀粉粒與花