食管癌組織中DAN聚合酶β啟動(dòng)子突變的初步研究.pdf

1、授 予 單 位 代 碼學(xué) 號(hào) 或 申請(qǐng) 號(hào)密 級(jí): 1 0 4 5 9: 0 5 3 1 1 9 8 3: 公 開(kāi)鄭 州 大 學(xué)碩 士 學(xué) 位 論 文論 文 題 目作 者 姓 名 :食 管 癌 組 織 中 DA N 聚 合 酶 p 啟 動(dòng) 子 突 變 的初 步研 究于 雅 麗科 類(lèi) 別 醫(yī) 學(xué)業(yè) 方 向 : 生 物 化 學(xué) 與 分 子 生 物 學(xué)學(xué) 專(zhuān)導(dǎo)師 姓 名 、 職 稱(chēng) : 李 月 白 教 授二 零 零 八 年 五 月鄭州大學(xué)20

2、08屆碩士學(xué)位論文 食管癌組織中DN A 聚合酶 p 啟動(dòng)子突變 的初步分析子序 列 參 考 文 獻(xiàn) 川 ，設(shè)計(jì)擴(kuò)增 DNApo l p 基 因啟動(dòng) 子 引物 ，用PC R技 術(shù)擴(kuò) 增 出人類(lèi) 野 生型和 突 變 型p。 l p 基 因核 心 啟動(dòng) 子 片段 ，連 接載 體PG EM 一 TEas y并轉(zhuǎn)化 感受態(tài) 細(xì) 菌 夕 廳 百 a ，通 過(guò) Q 互 補(bǔ) 和 采 用 通 用 引 物 T7 /SP6 行 PC R 以 鑒 定 重 組

3、 子PG EMee T一 pol p /pro mot er 目的片段 是否 轉(zhuǎn) 入， 正反雙 向測(cè)序 后 ， 采 用DNA SI S 、 OM IGA軟件 將 測(cè) 序 結(jié)果 與Ge nB an k查 到DN Apo l p 啟 動(dòng)子序列 進(jìn) 行 同源 性 比較 ， 分 析 確 定野 生型pol p 啟 動(dòng) 子序列 和 突變 型p。 l p 啟動(dòng) 子 的突 變位 點(diǎn) 。3. 含 人 pe !p 基 因啟動(dòng)子 的螢光素酶報(bào) 告基 因表達(dá)

4、載體 的構(gòu) 建 及鑒 定 : 將提 取 測(cè) 序 正 確 的重 組 T 載 體 (pe雕 T一 po p /promoter )質(zhì) 粒 和 PG L3一 neo一 enhancer螢 光 素 酶報(bào) 告載 體 ， 分 別 用 Ih ol l 和 苗 川 IH 雙 酶切 ，回收純化 的雙 粘 pol p啟 動(dòng) 子 目的 片 段 亞 克 隆至 雙 粘 線(xiàn) 性 PG L3 一 ne o一 en han 。 er 螢 光 素 酶 報(bào) 告 載 體 ，

5、 得 到的重 組 質(zhì) 粒 pGL3一 neo一 po l p /prom。 ter 經(jīng) Ih ol l 和 苗 川 111 雙 酶 切 和 PCR 鑒 定后 ， 正 反雙 向測(cè) 序 以鑒 定 構(gòu) 建 的含 人 野 生型和 突變 型 Po l p 基 因啟 動(dòng) 子 螢 光 素 酶報(bào) 告 基 因表 達(dá) 載 體 的正 確 性 ，并 確 認(rèn) 突 變 存 在 位 點(diǎn) 仍 然 正 確 ，沒(méi) 有 發(fā) 現(xiàn) 其 它 差 異的存 在 。即構(gòu) 建 成 含 人

6、 野 生 型 和 突 變 型 pol p 基 因 啟動(dòng) 子 的 螢 光 素 酶 報(bào) 告 基 因表達(dá) 載 體 (pGL3 (w/M)po l p /promoter ) 。4 .細(xì) 胞 培 養(yǎng) 及 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 染 : 細(xì) 胞 分 為 4 組 :(1) 空 白組 : 未 轉(zhuǎn) 染 任 何 質(zhì) 粒 的Eea9706 細(xì) 胞 ; (2 ) 對(duì) 照 組 : 轉(zhuǎn) 染 pGL3一 neo一 enhaneer 空 載 體 ; (3 ) 野 生 組 :轉(zhuǎn)

7、染 含 人 野 生 型 p。 l p 基 因啟 動(dòng) 子 序 列 的螢 光 素 酶 報(bào) 告 基 因表 達(dá) 載 體 PG L3 wpo lp /Pr omo ter ; (4) 突 變 組 : 轉(zhuǎn) 染 含 人 一37 位 點(diǎn) C一A 突 變 的 pol p 啟 動(dòng) 子 序 列螢 光 素 酶 報(bào) 告 基 因 表 達(dá) 載 體 pGL3Mp。 l p /promoter 。用 脂 質(zhì) 體 L ipofe。 t二 ine2000 分 別 將 (2

8、)、(3 ) 和 (4 ) 組 轉(zhuǎn) 染 Eea9706 細(xì) 胞，G4 18 篩 選 陽(yáng)性 細(xì) 胞 克 隆 。每 組 至 少 重 復(fù) 實(shí) 驗(yàn) 3 次 。5.螢 光 素 酶 活 性 檢 測(cè) : 采 用 螢 光 素 酶 螢 光 檢 測(cè) 儀 作 各 組 螢 光 素 酶 活 性 測(cè) 定 ，將 各 組 的測(cè) 得 數(shù) 值 取 平 均 值 。6.統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 處 理 : 螢 光 素 酶 活 性 檢 測(cè) 數(shù) 據(jù) 分 析 處 理 用 了士s 表 示 ， 用