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文檔簡介
1、流感病毒反向遺傳系統(tǒng)能夠在體外對流感病毒的基因組進行操作,可以極大的方便對流感病毒的研究。流感病毒最小的復(fù)制單位由核糖核蛋白復(fù)合物(ribonucleoprotein complex,RNP)組成。在流感病毒反向系統(tǒng)中,PB1、PB2、PA、NP蛋白可以識別由I型RNA聚合酶啟動子驅(qū)動生成的負鏈病毒RNA,并以此為模板轉(zhuǎn)錄生成正鏈互補RNA及mRNA。真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動子具有種屬特異性。一種生物的Ⅰ型RNA聚合酶不能識別另一種
2、生物的Ⅰ型RNA聚合酶啟動子。研究者已經(jīng)克隆了人源、犬源、雞源、鼠源Ⅰ型RNA聚合酶啟動子,并將其用于流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建。但是,目前為止,還沒有馬源Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的研究報道。因此,對于流感病毒的很多研究不能在馬源細胞上進行?;诖?,在本研究中,利用真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的位置特點,在GenBank數(shù)據(jù)庫和ensembl數(shù)據(jù)庫中的馬基因組中,檢索并確定了馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點。以馬肺細胞基因組DNA為
3、模板,通過PCR,擴增得到了馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子,并構(gòu)建了不同長度的馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子驅(qū)動的馬流感病毒小基因組復(fù)制系統(tǒng)。結(jié)果表明馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子為500bp時,可以發(fā)揮最大轉(zhuǎn)錄活性。用建立的馬流感病毒小基因組復(fù)制系統(tǒng),對比了兩株馬流感病毒聚合酶活性的差異,發(fā)現(xiàn)PA蛋白可能是決定兩者聚合酶活性差異的關(guān)鍵蛋白。在本研究中,還使用該系統(tǒng)證實了馬MxA蛋白會影響流感病毒聚合酶活性。最后,利用馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子構(gòu)建了馬流感
4、病毒反向遺傳系統(tǒng),成功拯救出一株野生型馬流感病毒和一株重組型馬流感病毒。馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的成功克隆及應(yīng)用,豐富了我們對真核生物Ⅰ型RNA聚合酶啟動子的認(rèn)識。利用馬Ⅰ型RNA聚合酶啟動子構(gòu)建的流感病毒小基因組復(fù)制系統(tǒng)是在馬源細胞上研究流感病毒聚合酶活性的有效工具,而在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的馬流感病毒反向系統(tǒng)將方便研究者在馬源細胞上對流感病毒進行操作。
最近的研究表明,人源、豬源、雞源、鴨源、鼠源IFITM蛋白都具有抗流感病毒活性
5、。馬屬動物是流感病毒的重要宿主,但對于馬源IFITM蛋白是否也具有抗流感病毒作用卻未見報道。在本研究中,通過在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索馬IFITM基因,設(shè)計了靶向馬IFITM基因的特異性引物。通過RT-PCR,擴增得到了6個馬IFITM基因。首先,我們描述了馬IFITM mRNA的表達特性:通過熒光定量PCR,檢測了馬源細胞及組織中的IFITM mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)不同IFITM的mRNA表達水平有所差異;經(jīng)干擾素處理和流感病毒感染
6、后,馬源細胞中IFITM mRNA表達水平會上調(diào);但是感染馬皰疹病毒后,馬源細胞中IFITM mRNA表達水平未發(fā)生變化。然后,為了明確馬IFITM蛋白的細胞定位,構(gòu)建了表達馬IFITM蛋白的真核表達載體,間接免疫熒光和Western blot實驗都表明馬IFITM蛋白成功表達;激光共聚焦實驗的結(jié)果表明不同馬IFITM蛋白的細胞定位并不相同;其中,馬IFITM3蛋白與LAMP1蛋白呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象,而其它馬IFITM蛋白不與LAMP1蛋白
7、共定位。最后,通過瞬時轉(zhuǎn)染外源表達質(zhì)粒和構(gòu)建穩(wěn)定表達IFITM蛋白細胞系這兩種策略,利于基于I型RNA聚合酶啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng),檢測了馬IFITM蛋白的抗流感活性:通過慢病毒感染實驗,建立了穩(wěn)定表達馬IFITM蛋白的MDCK細胞系;間接免疫熒光試驗的結(jié)果表明,在MDCK細胞系中,馬IFITM蛋白都成功表達;利用基于馬或犬I型RNA聚合酶啟動子的雙熒光素酶報告系統(tǒng),證實在細胞中過表達或者穩(wěn)定表達馬IFITM蛋白都會限制流感病毒復(fù)制
8、。對馬源 IFITM蛋白的抗流感病毒活性研究,將加深我們對IFITM蛋白抗流感病毒作用的理解,也為相應(yīng)的抗流感藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。
2012年以來,在馬群中發(fā)現(xiàn)了三種新的黃病毒科病毒:馬丙型肝炎病毒(equine hepatitis C virus,EHCV)、EPgV(equine pegivirus)、泰勒病相關(guān)病毒(Theiler’s disease-associated virus,TDAV)。目前,在世界范圍內(nèi)
9、,關(guān)于這三種新發(fā)馬病病毒的報道較少。在國內(nèi)的馬群中,也沒有這三種病毒的流行病學(xué)報道。在2014年和2015年,我們從國內(nèi)的馬群中采集了177份血清樣品。通過PCR,在血清樣品中,檢測到了6份EHCV陽性樣品和2份EPgV陽性樣品。在檢測過程中,沒有發(fā)現(xiàn)這兩種病毒共感染的證據(jù)。在所有樣品中沒有檢測到TDAV核酸。對EHCV的NS5B基因、NS3基因、5’非轉(zhuǎn)錄區(qū)序列以及EPgV的NS3基因序列進行進化樹分析。結(jié)果表明,EHCV和EPgV已
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